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柑橘溃疡病菌检测的方法及防治技术的研究进展 　　摘要 从核酸杂交技术、DNA指纹图谱分析、PCR检测方法等方面对柑橘溃疡病菌检测方法及柑橘溃疡病的防治技术进行综述，并对柑橘溃疡病菌今后的研究方向进行展望，以供参考。 　　关键词 柑橘溃疡病菌；检测方法；防治技术 　　中图分类号 S436.661 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）22-0112-03 　　柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）属于国内外重要的检疫性有害生物，其病原菌为地毯草黄单胞柑橘致病变种。柑橘溃疡病在我国柑橘产区均有发生，在湖南、浙江、福建、云南、江西、广西、广东、贵州等南方柑橘种植省份（区）发生较为普遍，在四川、重庆、湖北等省份（市）有局部零星分布。柑橘感染溃疡病后，在叶、枝、果实上形成火山口状的病斑，后期可造成落叶、落果，严重影响柑橘果实的产量和品质。该文对柑橘溃疡病菌检测鉴定技术及防治措施进行了综述，并对今后柑橘溃疡病研究进行了展望，以为柑橘溃疡病的检测及防治提供参考依据和理论支持。 　　1 柑橘溃疡病菌检测鉴定方法研究 　　柑橘溃疡病菌的检测方法包括生物学检测法和现代分子检测技术。生物学检测法主要是按照“柯赫氏法则”来确定溃疡病病原物；而现代分子检测技术主要是通过现代分子生物学的技术手段，通过对病原物的基因进行检测分析。20世纪90年代以来，随着分子生物学的迅速发展，DNA杂交诊断、DNA指纹图谱分析、PCR检测等技术广泛应用，与植物致病性相关的基因不断地被鉴定和克隆出来，许多重大植物病害的检测鉴定已逐步进入分子水平。分子水平的检测具有快速、准确、灵敏的特点，可以满足国内外对植物检疫的要求，已成为当今植物病原物最重要的检测鉴定手段之一。 　　1.1 核酸杂交技术 　　核酸杂交技术是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列。核酸杂交技术用于溃疡病的检测原理是假设柑橘溃疡病菌基因组中有一系列随机的克隆DNA片段，因而可以根据其能与感病植物的DNA杂交而不与健康植物的DNA杂交进行筛选。因此，柑橘溃疡病菌特异性的DNA序列可进行标记用作DNA-DNA杂交分析中的探针。国外学者Hartung根据柑橘溃疡病A菌系质粒DNA的BamHI片断以及此片段内部的EcoR I片断，设计了2个探针，首次用核酸杂交技术对柑橘溃疡病菌进行了分子检测研究[1]。研究结果表明，这2个探针同柑橘溃疡病A菌系的杂交率为100%，同柑橘溃疡病B、C菌系的杂交率分别为86.7％和73.3％，同柑橘溃疡病其他菌系也均有较高的特异性（这2个探针不能检测柑橘溃疡病的E菌系）。核酸杂交技术相对于传统的接种检测技术，最大的优势在于缩短了检测时间，但是采用核酸杂交技术检测柑橘溃疡病菌整个过程比较繁琐，费时费事。因此，需要探索其他更加准确、快速、灵敏的检测技术来进行溃疡病菌的早期检测。 　　1.2 DNA指纹图谱分析 　　由于生物的不同个体、不同种群在DNA结构上存在明显的差异，因而可以通过限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RFLP）、随机扩增多态性分析（RAPD）、串联重复序列分析（short tandem repeat，PCR-STR）等多种检测手段，进行DNA多态性的检测，构建DNA指纹图谱分析。在柑橘溃疡病菌菌种鉴定中，可以通过DNA指纹图谱分析法进行菌系的划分。目前已有学者用RFLP进行柑橘溃疡病菌菌系研究的报道。DNA指纹图谱分析柑橘溃疡病运用较多的是RFLP分析，其方法是：分别提取标准柑橘溃疡病菌和待测菌株的基因组DNA（质粒DNA），用限制性内切酶水解，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和染色照相，最后将待测菌株与溃疡病菌的DNA指纹图谱进行比较分析，即可确定待测菌株的菌系类型。Hartung et al[2]对柑橘溃疡病各菌系的基因组DNA进行RFLP分析，很容易将柑橘溃疡病菌的A菌系和其他的B/C/D以及E 2种菌系区分开来。Pruvost et al对溃疡病菌的质粒DNA进行RFLP分析，也可以将溃疡病各菌系区别开来。 　　由于DNA 指纹图谱具有高变异性、多位点性、简单而稳定的遗传性，所获得的谱带具有简单、易于分析，不受菌株是否纯培养的限制，同时还具有效率高、特异性强的特点，广泛用于植物病原微生物的发现、分类鉴定、遗传多样性的分析等。 　　1.3 PCR检测方法 　　聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），是一种模拟生物DNA体内复制过程的体外DNA扩增技术，其过程主要分为3个部分：DNA变性、退火、延伸。20世纪80年代以来，PCR技术发展十分迅速。除常规的PCR技术外，目前用于植物病原菌检测的还有联合PCR（Co-operational