武汉地区黄瓜靶斑病病原鉴定及生物学特性的研究.docVIP

武汉地区黄瓜靶斑病病原鉴定及生物学特性的研究 　　摘 要：2011年7月在武汉黄陂发现黄瓜靶斑病，对病样进行分离、致病性测定、形态学鉴定，并对病原进行了生物学特性研究。结果表明，引起武汉地区黄瓜靶斑病的病原菌为多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。这是多主棒孢霉在武汉引起黄瓜靶斑病的首次报道。生物学特性研究结果表明，光照有利于病原菌菌丝生长；病原菌菌丝生长的适宜温度范围为25～30℃；最适宜pH值为6～9；病原菌能够利用多种碳源和氮源，碳源以麦芽糖利用效果最好，氮源以硝酸钾利用效果最好。 　　关键词：黄瓜；靶斑病；多主棒孢霉；生物学特性 　　黄瓜靶斑病（Corynespora cassiicola），又名黄瓜褐斑病，在我国辽宁[1，2]、河南、河北、山东、宁夏、甘肃、江苏、上海、广东等地黄瓜上发生严重[3～10]。2011年7月首次在武汉栽培黄瓜上发现有类似靶斑病的症状，2011-2014年武汉各露地蔬菜和设施蔬菜均发现有靶斑病为害。本研究在实验室条件下对病原菌的形态特征、致病性以及生物学特性进行了初步研究，以明确武汉地区导致该病害发生的病原菌种类及该病原菌对不同理化环境和营养条件的需求，以期对其发生规律和防治措施进行有效探索。 　　1 材料与方法 　　1.1 病样采集及症状观察 　　2011-2014年在武汉黄陂、蔡甸等蔬菜基地黄瓜上发现有疑似靶斑病症状，观察记录症状并拍照。 　　1.2 病样的分离 　　采用常规组织分离法[11]：取病斑典型的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净，切取病健交界处的组织，先用0.1%升汞消毒1～2 min，再用75%酒精消毒1 min左右，最后用无菌水冲洗3次，每次1 min。消毒完成后，吸干组织表面水分，再将可能被杀死的组织剪去，剪成小块，每皿3～5块，接在PDA平板上，置于25℃恒温箱中培养。菌落形成后，选典型菌落转接3次，进行纯化，4℃保存备用。 　　1.3 致病性测定 　　采用孢子悬浮液喷雾接种法：将菌株在PDA上暗培养，待产孢后在培养皿中加无菌水，再用干净玻片刮取孢子，4层纱布过滤制成孢子悬浮液，浓度为103～104个/mL。取生长良好、长出2片真叶的健康黄瓜苗，用上述孢子悬浮液喷雾接种到黄瓜叶片，接种后保湿24 h，观察记录发病情况，发病后再从发病部位取样进行再分离，以确定是否为致病菌。 　　1.4 病原菌形态学鉴定 　　通过柯赫氏法则验证，确定引起黄瓜靶斑病的病原。将供试菌株接种到PDA平板上，25℃培养箱暗培养，测量菌落生长直径，描述菌落颜色、形态，挑取培养物，用显微镜观察分生孢子器、分生孢子形态，测量其大小。 　　1.5 病原菌生物学特性 　　①光照对病原菌菌丝生长的影响 在活化培养7 d的菌落边缘，打取直径6 mm的菌饼，接种于PDA平板中央。将接菌后培养皿置于25℃ HP250GS智能型人工气候培养箱恒温培养。设置连续黑暗、12 h光暗交替、连续光照3个处理，每个处理3个重复，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。 　　②不同温度对病原菌菌丝生长的影响 在活化培养7 d的菌落边缘，打取直径6 mm的菌饼，接种于PDA平板中央，将接菌后的培养皿分别置于5、10、15、20、25、30、35、40℃恒温箱中培养，每个处理3个重复，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。 　　③不同 pH值对病原菌菌丝生长的影响 将PDA 培养基的 pH值分别调节为3.0，4.0，5.0，6.0， 7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，制成不同pH值的平板，在平板中央接种6 mm 的新鲜菌饼，3个重复，25℃恒温暗培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。 　　④不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响 以查氏培养基[11]为基础培养基。用含碳量相同的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的蔗糖。用含氮量相同的尿素、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、精氨酸代替其中的硝酸钾。在活化培养7 d的菌落边缘，打取直径为6 mm的菌饼，接种在不同碳、氮源平板中央，3个重复，置于25℃恒温箱培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。 　　2 结果与分析 　　2.1 黄瓜靶斑病田间症状及病原菌的分离培养 　　2011年7月在武汉黄陂武湖黄瓜展示田，发现黄瓜中下部叶片出现疑似靶斑病的症状。叶片发病初期为黄色水浸状斑点、稍凹陷。发病中期病斑扩大为近圆形、圆形或不规则形，灰白色，在圆形或近圆形病斑中央常会有淡黄色的小斑点（图1A）。中后期多个病斑常连成片。该病常与霜霉病、细菌性角斑病混合发生，易与细菌性角斑病混淆。 　　2011-2014年每年从发病严重的田块，采集疑似靶斑病病样标本，对8份样品进行分离，均能分离出棒孢霉属（Corynespora sp.）真