凡纳滨对虾血蓝蛋白蛋白质翻译后修饰水平多样性的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要 我国是世界上最大的对虾养殖生产国，但近年来传染性疾病特别是病毒性病和细菌 性病给对虾养殖业造成了巨大损失，故深入研究对虾自身免疫抗病机制，对实现对虾健 康养殖的目的具有重要意义。有趣的是，近年来发现存在于对虾血淋巴中的输氧蛋白— —血蓝蛋白（hemocyanin, HMC）还具有抗病毒、抑菌等多种免疫学功能，尤其是最近 课题组发现其功能多样性的分子机制可能与其分子多态性有关，但其在蛋白质翻译后修 饰水平是否存在多态性的研究尚不深入。为此，本研究以凡纳滨对虾血蓝蛋白为研究对 象，在课题组已有研究的基础之上，对其糖基化、磷酸化修饰进行了较为深入的探讨， 所获研究结果如下： 1、对虾血蓝蛋白糖基修饰多样性分析 首先，采用不同层析技术组合获得 5 种不同的 HMC 成分，即 S-HMC（分子筛层析）、 A-HMCs 和 A-HMCl（亲和层析）、AL-HMCs 和 AL-HMCl（亲和层析-ConA 凝集素柱层 析串联）。2-DE 分析显示，该 5 种 HMC 在 2-D 图谱上分别表现为 9、6、6、7、6 个等 电点和分子量大小存在差异的蛋白质点。在此基础之上，进一步选用 4 种凝集素（ConA， PNA，UEA 和 DBA）对其进行 2-D 凝集素印迹分析。结果发现，不同 HMC 对 4 种凝集 素的识别存在较大差异。如，S-HMC 9 个蛋白点中仅有 5 个蛋白点可与 ConA 发生特异 性结合，但全部蛋白质点均可识别其它 3 种凝集素；A-HMCs 6 个蛋白点均可与 ConA 和 PNA 相结合，但仅有 4、3 个点与 UEA 和 DBA 反应呈阳性；AL-HMCl 6 个蛋白点均 可被 ConA 和 UEA 所识别，但仅有 2、4 个点与 PNA 和 DBA 特异性显色。 继而，通过玻片凝集技术对该 5 种 HMC 的免疫学功能进行对比分析。结果显示， 不同 HMC 对不 同 病原 菌 的凝 集活 性存 在较 大 差异 ，其 凝集 活性 大 小顺 序大 致为 S-HMCA-HMCs 和 A-HMClAL-HMCs 和 AL-HMCl。如，AL-HMCl 对副溶血弧菌的 I 凝集效价分别为 S-HMC、A-HMCs、A-HMCl 和 AL-HMCs 的 32、8、8 和 2 倍。 最后，运用病原胁迫的方法比较不同病原胁迫下 HMC 糖基化修饰变化的情况。结 果发现，不同病原刺激可导致 HMC 的糖基化修饰程度发生不同程度的变化，其中副溶 血弧菌、大肠杆菌刺激对虾 24h 后，与对照组相比，其对 ConA 的识别强度降低 0.5 倍 和 0.68 倍，而在相同条件下乙型链球菌刺激可使 HMC 对 ConA 的识别强度升高 1.5 倍。 2、对虾血蓝蛋白磷酸化多样性的研究 首先，采用免疫印迹分析 HMC 的磷酸化修饰情况。结果发现，HMC 9 个蛋白点中 分别存在 4、3 点与 anti-Ser、-Tyr 抗体发生特异性结合。 继而，运用生物质谱技术对其磷酸化位点进行鉴定。结果显示，S-HMC，A-HMCs、 AL-HMCs 分别存在 4（S-112，S-251，Y-253，S-308）、5（S-251，Y-253，S-308，T-475， T-490）和 5（T-242，Y-253，T-274，Y-400，S-524）个磷酸化位点。有意思的是，与 S-HMC 相比，A-HMCs、AL-HMCs 磷酸化位点的相似率分别仅为 60、20%，推测可能与血蓝 蛋白的分子多态性有关。 最后，选用病原胁迫、免疫印迹等技术进一步比较 HMC 磷酸化修饰对不同病原胁 迫的响应程度。结果发现，对虾 HMC 3 种磷酸化修饰对不同病原刺激的响应程度存在 较大差异。其中，副溶血弧菌、乙型链球菌刺激对虾后，其 HMC 的 Ser，Thr 修饰情况 会随时间的延长而减弱，而大肠杆菌刺激后其变化规律正好相反。如副溶血弧菌、大肠 杆菌刺激对虾 24h 后，其 HMC 的 Ser 修饰程度分别为 1h 时的 0.47 和 2.38 倍。 综上所述，本课题研究主要发现凡纳滨对虾血蓝蛋白在糖基化、磷酸化修饰水平存 在多态性，该多态性可能与血蓝蛋白免疫学活性的发挥以及对虾抵抗不同病原微生物的 感染密切相关。所获研究结果，对丰富对虾血蓝蛋白的分子多态性研究，深入揭示血蓝 蛋白功能多样性的分子机制，阐明对虾免疫防御机制等具有重要的意义。 关键词：对虾；血蓝蛋白；糖基化修饰；磷酸化修饰；多态性；免疫 Abstract At present, China is the largest shimp producing country in the word. However, the global shrimp industry has suffered