猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测的方法的研究进展.docVIP

猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测的方法的研究进展 　　摘 要：该文介绍了猪传染性胃肠炎病毒基因组织结构和基因表达方式，并分析了各功能蛋白的主要功能，最后分别介绍了核酸探针、普通RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、套式PCR、荧光定量RT-PCR方法、环介导等温扩增技术等分子生物学检测方法在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用。 　　关键词：猪传染性胃肠炎；病毒分子；生物学检测方法 　　中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）12- 0110-02 　　猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）导致猪出现脱水、水样腹泻以及呕吐等为主要临床症状的高度传染性疾病，该病在春季、初秋以及冬季具有较高的发病率[1]。猪传染性胃肠炎最早发生于美国，随后在世界各地均有发生，我国于20世纪50年代首次发现该病，目前全国大部分地区均发生过猪传染性胃肠炎。不同日龄和品种的猪均可以感染传染性胃肠炎，其中以15日龄左右的仔猪发病后死亡率最高，高达100%；5周龄以上的仔猪感染传染性胃肠炎后死亡率较低，但是会影响仔猪后期的生长，降低仔猪的饲料利用率。目前，该病已被世界动物卫生组织列为B类必检传染性疾病。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，该技术已经广泛用于各种细菌性和病毒性疾病的检测[2]。本文综述了分子生物学技术在传染性胃肠炎中的应用，以期能为从事传染性胃肠炎诊断和防控的工作者提供帮助。 　　1 传染性胃肠炎病毒基因组结构和基因表达方式 　　1.1 TGEV基因组结构 传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，该病毒的基因组不分节段、单股正股RNA，具有高度传染性。传染性胃肠炎基因组全序列分为7个区29kb，结构序列为5-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3，并且该基因组的3-末端以共价键结合的poly结构，5末端有帽结构[3]。基因组1约有20kb，主要负责病毒的编码，其余基因均在近3端。传染性胃肠炎病毒全基因组编码由4种结构蛋白和3种非结构蛋白组成，其中基因7、基因3和基因1为非结构蛋白，N、M、sM、S为传染性胃肠炎的结构蛋白。 　　1.2 基因表达方式 传染性胃肠炎病毒在胞浆脱壳以后，其正链RNA就呈现了mRNA的功能，使基因1转录表达RNA聚合酶，同时该基因有作为模板合成负链RNA，进而亲代RNA与负链RNA形成双链复制中间体。因此，在感染传染性胃肠炎病毒的细胞内，可以检测出不完全RNA、基因组RNA、mRNA以及双链中间体4个特异性RNA，这可以作为猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测指标之一[4]。 　　2 结构蛋白及功能 　　猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白主要为S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是猪传染性胃肠炎病毒纤突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，该蛋白基因全长4.3kb，蛋白分子量为195～220ku；S蛋白不仅是决定猪传染性胃肠炎病毒抗原的重要结构，也影响着病毒对细胞的致病性、亲嗜性等。M蛋白是构成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前体是由膜外区、信号肽、极性区、跨膜区突于病毒粒子内C-端区等功能区域构成，分子质量为29～31ku；M蛋白不仅决定了病毒粒子的出芽位点和装配位点，也可以影响病毒变异。N蛋白是一种酸性蛋白质，分子量为47KDa，含有382个氨基酸残基，该蛋白不仅是猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白，同时对病毒基因组的加工、复制都具有重要作用。sM蛋白分子质量为78ku，含有1种小膜蛋白和82个氨基酸残基，该功能蛋白在抗猪传染性胃肠炎病毒感染的体液和细胞免疫中具有重要作用。 　　3 分子生物学检测方法 　　3.1 核酸探针 核酸探针检测方法的基本原理是利用核苷酸碱基互补，在碱基互补过程中，采用标记物标记与被检测靶序列互补的单链核酸分子，进而检测到目的核序列。该检测方法与扫描电镜、荧光抗体试验、病毒分离等相比，具有较好的特异性，并且可以实现快速检测的目的。现代研究表明[6]，不同的病毒探针可以分别扩增出与其对应的病毒模板，对其他病毒模板影响不大，同时核酸探针扩增的最低检测限为3 000～6 000个拷贝的单个病毒核酸，具有较高的特异性和敏感性。 　　3.2 普通RT-PCR方法 该检测方法使用的首要条件是知道被检测病原的相关目的基因序列，根据相关目的序列后，采用相关软件设计相应的引物，然后进行体外扩增目的基因，进而达到检测的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法检测猪传染性胃肠炎病毒，并采用相同浓度做重复性检测，结果显示RT-PCR扩增的特异性条带为590bp左右；然后又以猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒以及猪轮状病毒做特异性试验，结果显示仅有猪传染性胃肠炎病毒得到了特异性目的条带，