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猪卵母细胞冷冻技术的研究进展 　　摘要：综述了猪卵母细胞的冷冻保存方法和解冻方法，同时对保存效果、影响保存的因素、保护剂的选择等进行探讨。最后，展望了猪卵母细胞冷冻技术的应用前景。 　　关键词：卵母细胞；冷冻保存；猪 　　中图分类号：S828文献标识码：A文章编号：1006―6500(2008)03―0027―03 　　 　　近年来，随着动物胚胎生物技术的迅速发展，对卵母细胞的需求日益增加，仅通过回收体内成熟卵母细胞已经无法满足科研和生产的需要。而从屠宰场回收废弃卵巢加以利用以获取大量卵母细胞，可望成为一条有效的途径。动物卵母细胞是母系遗传信息的载体，通过冷冻保存动物的卵母细胞，不但可以建立雌性动物的基因库，还可充分利用卵母细胞资源，使体外受精、转基因和核移植技术研究不受时间和地域的限制。另一方面，通过体外受精实现胚胎的体外生产，也可为胚胎生物技术提供丰富的材料来源。猪卵母细胞冷冻的研究还可为丰富低温生物学的理论、方法和实践提供重要的依据。 　　 　　1　猪卵母细胞的冷冻保存方法 　　 　　1.1　玻璃化冷冻 　　玻璃化冷冻是把卵母细胞置于高浓度冷冻保护液中，经短时间平衡或不平衡，直接投入液氮保存。卵母细胞在冷冻液中脱水至一定程度后，内源性胞质大分子(如蛋白质、脂类)及已渗透入胞内的冷冻保护剂浓缩，在冷冻过程中形成胞内玻璃化而不形成冰晶，因而避免了细胞内形成冰晶造成的化学和物理损伤，使卵母细胞得到保护。目前，玻璃化冷冻多采用两步法，即先用低浓度的冷冻保护剂预平衡3～5min，再放入终浓度冷冻液，立即装管，经液氮熏蒸1～2min后或不熏蒸而直接投入液氮。该法的特点是细胞在室温脱水后不需要降温程序，简便易行。 　　1.1.1　麦管(Straw)法　以EFS40作为玻璃化冷冻液。GV期或MⅡ期卵母细胞经TCM199清洗后转移到EFS20中，平衡1min，再转移到数个约100μL的EFS40小滴中，每滴约含卵母细胞15枚，并平衡1min。利用虹吸或注射器吸入麦管。装完管后，在液氮蒸汽中平衡3min后投入液氮或直接投入液氮中。 　　1.1.2　GMP管法　卵母细胞平衡后吸入GMP管。吸入的物质全部为含卵母细胞的冷冻液。装管完成后，在液氮蒸汽中平衡3min后投入液氮。 　　研究表明GMP的内径较小，且热传导性能好，故降温速率更快，冷冻效果好；此外，GMP还可以克服OPS管在液氮中容易上浮和炸裂的缺点，便于储存。 　　 　　1.2　程序化冷冻 　　卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理后，以1℃/min速度降温，在-5～-7℃诱发结晶，然后以0.3～0.8℃/min的速度降温至一30～-40℃，投入液氮中保存。将GV期或MⅡ期卵母细胞在TCM199中洗2-3次，转移到冷冻保护剂(EG，DMSO，Gly)中，进行逐步浓度梯度平衡。然后装入0.25mL的塑料麦管，每管含卵母细胞约15枚。装管完成后，放人已设置好的程序化冷冻仪中。 　　 　　1.3　OPS法 　　Vajta等使用OPS法获得成功，大大提高了猪卯母细胞的存活率。他将普通0.25mL细管加热，拉制成约为原来1/2的内径，将胚胎放入1～2μL的冷冻液后利用虹吸法将卵母细胞吸入拉制后的OPS管。由于OPS管内径更细，减少了卵母细胞周围的冷冻液量，从而使冷冻速率大大提高，使卵母细胞在冷冻过程中可迅速通过致死温区而不至于受到损害。Francoise等已利用OPS法冷冻猪卵母细胞，移植后获得冻胚仔猪。 　　 　　1.4　微滴法 　　微滴法(microdroplet)是使用微量冷冻液进行冷冻的一种方法。将含有卵母细胞的冷冻小滴(约6μL)直接滴入到液氮中冻成固态，然后收集这些固态颗粒于小管中，置于液氮中保存。另一种做法是，先在1mL冷冻管中做成含卵母细胞的微滴，然后将冷冻管直接投入液氮中保存。微滴法操作简单，在猪上的应用也取得突破。Misumi等用微滴法保存猪卵母细胞，解冻并培养24h后，卵母细胞存活率为91.3％，显著高于细管法，经胚胎移植后共获得27头仔猪，表明有较好的效果。 　　 　　1.5　电镜铜网法 　　电镜铜网法是新近出现的一种玻璃化冷冻方法。它利用电镜铜网作为卵母细胞载体，使卵母细胞处于小体积(1μL)冷冻液中，然后直接投入液氮保存，其冷冻速率可达3000℃/min以上。Martino等用电镜铜网法冻存猪卵母细胞，解冻后形态正常率为60％，体外受精后卵裂率和囊胚发育率分别达到29％和10％。 　　 　　1.6　固体表面法和冷冻环法 　　Begin等用固体表面法(solid-surface vitri-fi-cation，SSV)和冷冻环法(cryoloop virification，CLV)进行猪卵母细胞的超低温冷冻，其中，SSV法是