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蓖麻花药愈伤组织诱导及防褐化的研究 　　摘要：通过改变花药接种前的预处理、培养条件，建立了高效蓖麻花药愈伤诱导体系，结果表明：以通蓖5号为试材，4 ℃预处理3 d，维生素C浸泡1.5 h，培养基中添加活性炭0.6 g/L、维生素C 200 mg/L，暗培养15 d可获得高诱导率、低褐化率的蓖麻花药愈伤组织。 　　关键词：蓖麻；花药；诱导愈伤；防褐化 　　中图分类号： S565.604.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0039-02 　　蓖麻（Ricinus communis L.）为多年或一年生双子叶植物，多用于航空航天、化工、医药等行业，应用价值高、市场潜力大[1]。我国是蓖麻种植大国，但蓖麻新品种的开发一直局限于杂交、选择等传统育种方式，没有将现代育种技术应用于蓖麻育种[2]。花药培养可获得蓖麻育种上广泛应用的纯系品种，但较低的蓖麻花药愈伤诱导率、高褐化率一直是限制蓖麻花药离体培养的主要限制性因素。外植体培养过程中褐化的原因很多，机理较为复杂，多认为是培养条件、细胞死亡或是细胞中的酚类物质变质等因素导致[3]。本研究通过接种不同基因型、维生素C浸泡、改变培养条件（暗培养、添加防褐物），探索适宜蓖麻花药培养的最适条件，以期有效提高诱导率、降低褐化率，建立高效蓖麻花药愈伤诱导体系。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　哲蓖4号、通蓖5号、通蓖9号蓖麻花药，采自内蒙古民族大学试验农场。在温度较低、日照较弱时，取健壮无病的植株上花被尚未张开且呈淡黄色的花蕾。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 材料准备 本研究根据黄凤兰等研究[4]，取同时期、质优的花蕾，流水冲洗30 min，75%乙醇消毒30 s、0.1%HgCl2灭菌2 min，无菌水冲洗3～5次，转移至铺有灭菌滤纸的培养皿。去除花丝，每瓶接种1/3个花蕾（约230个），封口后置于培养室培养。在以下的试验设计中，每个处理接种5瓶，3次重复。基础培养基：MS+蔗糖40 g/L+琼脂7 g/L+脯氨酸600 mg/L+酸性水解酪蛋白600 mg/L+NAA 1.0 mg/L+ZT 3.0 mg/L，pH值=6.0。 　　1.2.2 蓖麻花药诱导愈伤防褐化体系筛选 　　1.2.2.1 不同基因型及低温预处理愈伤诱导率和褐化率 取哲蓖4号、通蓖5号、通蓖9号花药，在相同培养条件下筛选最佳花药愈伤诱导基因型，并统计花药低温预处理1、3、5、7、9 d时的诱导率及褐化率。 　　1.2.2.2 暗处理对愈伤组织诱导的影响 以通蓖5号花药为材料，接种后暗处理0、5、10、15、20 d，统计花药愈伤诱导率及褐化率。 　　1.2.2.3 维生素C浸泡处理对愈伤组织诱导的影响 以通蓖5号花药为材料，置于100 mg/L 维生素C中分别浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h，统计蓖麻花药愈伤组织的诱导率与褐化率。 　　1.2.2.4 防褐附加物对愈伤组织诱导的影响 以通蓖5号花药为材料，分别接种于添加不同浓度活性炭 （0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/L）和维生素C （0、100、150、200、250 mg/L）的培养基中，统计诱导率及褐化率。 　　2 结果与分析 　　2.1 不同基因型及低温预处理愈伤诱导率和褐化率 　　从表1可知，3个基因型的愈伤诱导率均随着低温预处理时间的增加呈先增后减的趋势，褐化率均呈先减后增的趋势，且均在低温处理3d时褐化率最低。褐化具有一定的传播性，故选择褐化率最低、诱导率最高的最适基因型。综合表1可知，愈伤组织的褐化率与基因型差异相关，通蓖5号在低温预处理3 d时褐化率最低（3.20%），且此时3个基因型中通蓖5号愈伤诱导率也最高（15.94%）。 　　2.2 暗处理对愈伤组织诱导的影响 　　如表2所示，花药愈伤诱导率随暗处理时间的增加有所提高，愈伤褐化率随时间的增加先减后增，且在暗处理15 d时愈伤诱导率达到最大值、褐化率达到最小值。 　　2.3 维生素C浸泡处理对愈伤组织诱导的影响 　　如表3所示，维生素C浸泡处理显著提高了花药愈伤诱导率，褐化率随着时间的增加呈先减后增的趋势。浸泡1.5 h时诱导率最高（28.56%）、褐化率最低（7.42%）。 　　2.4 防褐附加物对愈伤组织诱导的影响 　　由表4可知，随着活性炭量的增加，诱导率呈先升后降的趋势，褐化率呈先降后升的趋势，且浓度为0.6 g/L时诱导率最高（32.83%）、褐化率最低（11.28%）。培养基中添加维生素C后，诱导率及褐化率与添加活性炭的变化几乎一致，且浓度为200 mg/L时获得最大花药愈伤诱导率（27.32%）、最小褐化率（8.21%）。蓖麻花药愈伤诱导过程见图1。 　　3 讨论