金耳菌丝体醇提物体外抗肿瘤抗病毒活性的研究.docVIP

金耳菌丝体醇提物体外抗肿瘤抗病毒活性的研究 　　摘要:采用体外肿瘤细胞株(小鼠白血病细胞株L1210、人乳腺癌细胞株MCF-7和人肠腺癌细胞株SW620)的增殖抑制试验模型和抗病毒(流感甲型病毒和疱疹病毒)的筛选模型,对3个金耳(Tremella aurantialba)菌株菌丝体醇提物活性进行比较研究。抗肿瘤试验结果表明,3种提取物材料在高浓度(200 μg/mL)时,对3个供试肿瘤细胞株的细胞增殖均有明显的抑制作用,其中以YK的抑制活性最高(对L1210、SW620和MCF-7的抑制率分别为89.4%,75.0%和64.1%);在中浓度(50 μg/mL)时,均表现出一定的抑制作用;而在低浓度(10 μg/mL)时,则均无明显的抑制作用。抗流感甲型病毒和抗疱疹病毒试验结果表明,只有YK对流感甲型病毒表现有抗病毒活性,但此活性较弱。 　　关键词:金耳;醇提物;抗肿瘤;抗病毒 　　 　　金耳(Tremella aurantialba Bandoni et Zang.),属于担子菌亚门 (Basidiomycotina),层菌纲(Hymenomycetes),银耳目(Tremellales),银耳科(Tremellaceae),银耳属(Tremella)。金耳又名脑耳,表面金黄色,是我国传统的珍稀食、药用菌,其口感润滑细腻,是高级宴会上的名贵佳肴,同时也是补益身心、延年益寿的著名滋补珍品[1]。 　　目前有关金耳的研究主要集中于金耳多糖,已有多项研究表明,金耳多糖具有增强免疫功能[2]、降血糖[3, 4]、降血脂[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]等功效;但对于金耳菌丝体有机溶剂提取物生物活性的研究报道较少,目前仅有牛四坤等[7]报道过金耳菌丝体抗凝血的有效部位为正丁醇提取部位,而有关金耳不同菌株菌丝体乙醇提取物的生物活性目前尚未见报道。本试验对金耳的3个菌株菌丝体醇提物的抗肿瘤和抗病毒活性进行了研究。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　 　　1.1材料 　　1.1.1供试菌种 　　金耳YN0633、JK和YK菌种由上海市农业科学院食用菌研究所提供。 　　1.1.2肿瘤细胞株 　　小鼠白血病细胞株L1210、人乳腺癌细胞株MCF-7和人肠腺癌细胞株SW620均购自中国科学院细胞研究所。 　　1.1.3培养基 　　母种培养基:PDA培养基。 　　液体发酵培养基:蔗糖2%,玉米粉1.2%,酵母膏0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.01%。 　　1.2试剂 　　 　　5-Fu为Sigma-Aldrich公司产品,二甲基亚砜(DMSO)为AMERSCO产品,RPMI-1640和胎牛血清(FBS)为GIBCO公司产品,显色剂Alamar Blue为Biosource公司产品,病毒唑(RBV)为浙江康裕药业有限公司产品,无环鸟苷(ACV)由湖北科益制药厂生产。其他试剂均为国产分析纯。 　　1.3金耳菌丝体培养 　　液体发酵培养基装液量100 mL/250 mL,接种量10%,140 r/min,25 ℃下培养5 d,纱布过滤,菌丝体经蒸馏水冲洗数次后,冷冻干燥至恒重,称重,3次重复。 　　1.4醇提物的制备 　　将不同金耳菌株菌丝体分别用粉碎机粉碎成粉末状后,加入10倍量的95%乙醇回流提取6 h后,滤纸过滤取上清,400 g离心10 min去除杂质,上清液用R210/V850旋转蒸发仪(BüCHI公司)减压浓缩,冷冻干燥仪(Thermo Savant公司)进行冷冻干燥,得到3个金耳菌株的菌丝体醇提物,称重。各醇提物分别使用二甲亚砜(DMSO)稀释为10 μg/mL、50 μg/mL和200 μg/mL。 　　1.5金耳醇提物对肿瘤细胞的抑制试验 　　1.5.1肿瘤细胞的培养 　　悬浮肿瘤细胞株L1210:在37 ℃、含5% CO2条件下,用RPMI1640完全培养基传代培养,混悬液300 g 离心3 min后,去除上清,收集细胞。 　　贴壁肿瘤细胞株SW620和MCF7:在37 ℃、5% CO2条件下,用RPMI1640完全培养基传代培养,用0.25%胰酶或5%EDTA溶液消化,混悬液300 g 离心3 min后,去除上清,收集细胞。 　　1.5.2抑癌试验 　　将收集的肿瘤细胞均用RPMI1640完全培养基稀释到1×104 个/mL。取199 μL细胞液接于96孔板中,然后加1 μL待测样品,阴性对照以1 μL DMSO替代,阳性对照以5-Fu替代。细胞培养72 h后,分别于570 nm和600 nm测定吸光值,每孔加20 μL显色剂Alamar Blue,培养6～8 h后,再分别于570 nm和600 nm测定吸光值。细胞抑制率按照Alamar Blue As