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不同甘蔗品种DNA甲基化剖析 　　摘 要：DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一，在基因表达调控中发挥着重要的作用。本研究应用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术，在全基因组水平上研究不同品种甘蔗伸长期和成熟期CCGG位点的DNA甲基化水平及模式变化特征。结果表明，在伸长期，8个甘蔗品种检测到的DNA甲基化率为15.47 %～29.03 %；引物平均甲基化率为28.86 %。在成熟期5个甘蔗品种中检测到的DNA甲基化为6.98 %～14.94 %。表明DNA甲基化在甘蔗中发生频繁，且品种之间的甲基化模式存在差异，甘蔗CCGG序列中胞嘧啶甲基化内侧胞嘧啶全甲基化多于外部胞嘧啶半甲基化。 　　关键词：甘蔗 DNA甲基化 MSAP 　　广西是国内主产蔗区，蔗糖业是广西重要支柱产业。自20世纪90年代初，广西蔗糖业成为全国第一后，广西甘蔗生产占有的比重不断增加，进入21世纪以来广西蔗糖年产量占全国食糖总产量的60 %以上[1]。 　　DNA甲基化是一种表观遗传（epigenetic）现象。在发育过程中，虽然基因表达调控发生改变，但DNA的一级结构没有变化，它可以遗传，也可能发生逆转（脱甲基化）[2]。在高等植物中，胞嘧啶甲基化在基因表达调控中扮演了很重要的角色[3-5]。检测DNA甲基化的方法有多种，MSAP（Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，甲基化敏感扩增多态性）技术，是在AFLP技术基础上建立起来的，之后被用于水稻基因组胞嘧啶甲基化的检测上[6]，现已广泛应用于棉花、苹果、拟南芥、香蕉、土豆、草莓等植物上，评估胞嘧啶甲基化的程度和模式[7-12]。鉴于此，研究从表观遗传学的角度出发，采用MSAP技术检测不同甘蔗品种不同时期的甲基化多态性，分析甘蔗生长过程中DNA甲基化水平、模式与变化，为进一步开展相关研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试8个甘蔗品种信息列于表1。试验材料种植于广西农业院甘蔗研究所本部试验农场。 　　1.2 总DNA提取与MSAP分析 　　选取生长正常的伸长期和成熟期单株，取其1叶用于DNA提取。DNA提取及MSAP分析参照Xiong方法实施 [13]。 　　1.3 数据处理 　　标记MSAP 扩增片段大小，以0和1建立数据库。在相同迁移率位置上，有带的记为1 ， 无带的记为0 。参照DNA分子标记数据分析方法， 将MSAP标记作为等位基因进行多态性研究， 每1条扩增条带视为1个性状。 　　2 结果与分析 　　2.1 DNA质量检测 　　取1μL 基因组DNA用NanoDropND-1000紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，OD260/ OD280比值在1.8～2.0范围内，纯度较高，取出2μL纯化的基因组DNA用0.8 %琼脂糖凝胶检测结果如图1、图2所示，DNA主带清晰，降解较少，适合进行下一步分析。 　　图1中1～8分别为柳城05-136、桂糖03-1438、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂糖06-1001、桂引C1-2003、桂糖06-244、桂糖06-1721。 　　图2中1～5分别为柳城05-136、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂引C1-2003、桂糖06-244。 　　2.2 甘蔗品种甲基化分析 　　2.2.1 甲基化模式 　　根据HpaII和MspI对CCGG序列甲基化是否敏感， 可将酶切结果分4种不同类型，见表2、图3。 　　2.2.2 伸长期甲基化分析 　　使用不同引物甲基化的差异见表3。 　　3对引物扩增结果表明，不同引物间甲基化略有差异，引物E7+H/M5甲基化多态性条带最多，达14条，甲基化率为30.43 %；引物E5+H/M5甲基化多态性条带仅为8条，甲基化率为27.59%，在3对引物中甲基化率最低。 　　在甘蔗伸长期， 用3对MASP引物分析8个甘蔗品种甲基化程度，共检测到590个位点，见表4。总甲基化的位点数（包括全甲基化和仅一条链甲基化的半甲基化）分别为19、13、15、19、19、17、10和27，甲基化率分别为18.63 %、15.48 %、15.96 %、19.59 %、21.11 %、19.32 %、12.35 %和29.03 %。其中，全甲基化（双链甲基化）的条带数分别为10、8、10、14、11、8、7和18，全甲基化比率分别为9.80 %、9.52 %、10.63 %、14.43 %、12.22 %、9.09 %、8.64 %和19.35 %。半甲基化的带数分别为9、5、5、5、8、9、3和9，半甲基化率为8.82 %、5.95 %、5.31 %、5.15 %、8.89 %、10.23 %、3.70 %和9.68