四级杆串联质谱剖析苄嘧磺隆污染蟾蜍耳后腺中蟾蜍甾烯水平.docVIP

四级杆串联质谱剖析苄嘧磺隆污染蟾蜍耳后腺中蟾蜍甾烯水平 　　摘 要 研究了除草剂苄嘧磺隆皮肤接触污染对中华大蟾蜍分泌蟾酥化学品质的影响。蟾酥样品经甲醇提取，以乙腈-1%甲酸水溶液为流动相，液相色谱（反相C18柱）分离＼， 串联质谱（LC-MS/MS）分析检测。质谱条件为：MRM模式，脱溶剂温度500℃，碰撞电压30 eV，锥孔电压为30 V。结果表明，建立的LC-MS/MS测定方法对6种蟾蜍甾烯标准物质的检出限为0.42～4.86 ng/mL，相关系数R2=0.9953～0.9992，日内和日间RSD为3.8%～6.8%和4.0%～8.8%；加样回收率为96.9%～109.6%，相对标准偏差为2.0%～8.1%。应用此方法检测了36种蟾蜍甾烯化合物，有20余种化合物自身质谱积分面积在苄嘧磺隆污染前后发生改变，苄嘧磺隆皮肤接触污染可以改变蟾蜍耳后腺蟾蜍毒素的表达模式。本方法可应用于蟾蜍甾烯类物质检测。 　　关键词 中药资源学； 蟾蜍； 苄嘧磺隆； 蟾酥 　　1 引 言 　　蟾酥为中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider耳后腺的干燥分泌物。以往研究显示，蟾酥化学质量差异较大[1，2]，不同产地商品中蟾蜍甾烯类成分含量相差数倍至数十倍。其原因除了遗传因素外，环境影响尤为重要。据调查，中药材蟾酥主要来自于野生蟾蜍，蟾蜍皮肤具有通透性，对环境重金属、农药、生活（工业）污水敏感[3]，是环境科学研究的前哨物种。污染物能在蟾蜍体内蓄积和放大，但是污染物对蟾蜍耳后腺分泌物形成的影响研究甚少。 　　蟾酥主要含有强心苷类蟾蜍甾烯化合物，其含量测定方法大体可分为有LC-UV和LC-MS两类。MS在蟾蜍甾烯定性鉴别和定量灵敏度方面均显著优于UV方法。已有学者采用Q-TOF和LTQ-Orbitrap对多种蟾蜍甾烯的质谱二级裂解模式进行特征和含量分析[3～10]。在此基础上，本研究采用四级杆串联质对蟾酥中36种蟾蜍甾烯进行检测，以质谱积分面积表示每种蟾蜍甾烯化合物在不同样本组间的相对含量（化合物自身比较），并结合数学模式识别方法，评估苄嘧磺隆污染前后蟾蜍分泌蟾酥化学性质的变化。2 实验部分 　　2.1 仪器与材料 　　Waters Xevo-TQ 三重四极杆质谱仪， 配备Acquity UPLC 系统（包括四元泵溶剂系统、在线脱气机和自动进样器）， 同时配有Waters Masslynx V4.1数据工作站 （美国Waters 公司）； 低温超高速离心机（美国Thermo公司）；离心浓缩仪、冷冻干燥仪（Labconco公司）；EPED超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）；电子分析天平（上海精密仪器厂）； 蟾蜍甾烯标准品Cinobufotalin，Resibufagenin，Gamabufotalin，Hellebrigenin，Cinobufagin 和Bufotalin按文献[1]报道方法分离制备，高效液相色谱鉴定纯度大于95%；苄嘧磺隆（丁贝生物公司）。中华大蟾蜍（捕于南京周边）。 　　2.2 苄嘧磺隆污染蟾蜍的分组与取样 　　中华大蟾蜍30只， 产地为江苏省，均分成3组，组间个体无显著差异。配制苄嘧磺隆低剂量组（0.15 g/L），高剂量组（0.3 g/L）及正常组（0 g/L）。中华大蟾蜍饲养在含或不含苄嘧磺隆的水溶液中。用分析天平称取苄嘧磺隆0.15和0.30 g，加到1 L盛有隔夜自来水的烧杯中，搅拌，使之充分溶解。待蟾蜍取食完毕后，将上述配好的药液倒入蟾蜍培养箱中，培养2天后，倒掉培养箱中原液，把培养箱冲洗干净，给蟾蜍喂食，待取食完毕后，加入药液，如此反复，培养半个月。抓取蟾蜍，称体重。用包裹胶布的镊子挤压蟾蜍耳后腺，使蟾酥喷溅到载玻片上，将鲜酥刮至EP管中，冷冻干燥，记录冻干前后蟾酥的重量。 　　2.3 供试品溶液的制备 　　将干燥后的蟾酥样本于研钵中研磨成粉末（未过筛），每个样本准确称取10 mg，置于玻璃试管中，分别准确加入5 mL甲醇，保鲜膜封口，超声提取30 min，冷却后经0.22 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。 　　2.4 色谱/质谱条件 　　ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）； 柱温35.0℃；流速0.4 mL/min； 进样量5 μL；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序： 0～2 min， 20%～30% B； 2～6 min， 30%～35% B； 6～9 min， 35%～60% B； 9～10 min， 60%～95% B； 10～11 min， 95% B； 11～11.20 min： 95%～20% B。