fat1转基因小鼠的构建与鉴定　.docVIP

fatl转基因小鼠的构建与鉴定 】目的构建和鉴定携带有外源fat?l基因的转 基因小鼠。方法将fat?l基因的cDNA与动物表达载体 pEF?neo连接，构建pEF?fat?l重组质粒，酶切、测序鉴定 正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精 卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出 转基因小鼠，通过PCR、Southernblot杂交等方法确立阳 性整合有目的基因的GO代小鼠。结果成功构建了 pEF?fat?l重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到 GO代小鼠，PCR、Sout hernbl ot杂交确立了 4只整合有 fat?l基因的首建鼠。结论f at?l基因可整合到小鼠体内， 得到的转基因小鼠为研宄fat?l基因的生物学功能提供了 动物模型。 关键词】小鼠转基因DNA重组fat?l基因 [ABS TRACT] Objec tiveT oconst ruct andiden tif ythetran sg enicmicew i thextrinsi cfat?lgene. MethodsFat? lcDNAandan i malexpres si onvector pEF ?neower econ jugate dtoco nstru ctther ecom binantp las midpEF?f at ?lwhichwa s digestedby restrictenz ymeandseque ncedcorrec t ly. Theobt ai nedlinea rre combina ntpl asmidp EF?fa t?lwa smicro inje ctedint oth earsenob la stsofmous e zygote, whi chwasimplan tedintotheu terustopro d ucetransg en icmice. P CRa ndSouth ernb lotwer eperf ormed toiden tify theposi tiv eGOgener at ionoffat? 1 transgenic mice. Result sRecombinan tplasmidpE F ?fat?lwas su ccessful lyc onstruc teda ndfour GOmic ewith integr ated fat?lge new ereident if iedviaPCR a ndSouthern ?lgenecanbe integratedi ntomouseto o btainthet ra nsgenicm ous ethatpr ovid esanan imalm odelf orthes tudy offat?l gen e. [KEY W ORDS ] mice, transgenic; DNA, recombi nant;fat?l g ene fat ?1基因来源于小秀丽线虫，S PYCHAL LA等[1 ] 利用在阿拉伯芥(Ar abid opsis)中进行异种表达的方法 确认了 f at?lcDNA的序列。此cDNA的翻译产物是由402个 氨基酸组成的n?3多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)脱氢酶，相 对分子质量为万，是氧离子依赖的含铁酶，属于跨膜蛋白 超家族。此酶的功能是以16?2 0碳的n?6PUFAs为底物进 行脱氢反应，生成相应的n?3PUFA So体外实验表明，fa t ?lcDNA的表达可促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖 保护神经细胞，并可改变细胞膜n ?6/n?3PUF As的比例，降 低来源于n?6PUFAs的类花生酸的组成[2?7]。本文旨在 构建和鉴定fat?l转基因小鼠，从而为f at?l基因在动物 整体水平上的研究提供实验模型。 1材料和方法 材料 菌株XLl?Blue及pEF?neo质粒由中国科学院遗传与发 育生物学研究所提供。pcD NA?fat?l质粒（内含fat?lcDNA 由本室保存。各种限制性内切酶、DNA分子质量标准入 DNA/Eco R I +HindIII及 T4 D NA 连接酶等均购自 P romega 公 司；PC R引物由上海生工公司合成，DNA测序由北京三博远 志生物公司完成。琼脂糖购自华美生物工程公司。DNA凝胶 回收试剂盒购自Omega公司。其他试剂均为国产分析纯。 方法 重组质粒pE F?fat?l的构建p c DNA?fat?l及表达载体 pEF?ne0用EcoRI/Xbal进行双酶切，8g/L琼脂糖凝胶电 泳，分别回收、纯化kb片段和大片段。将kb的目的片段 和载体片段以摩尔比3 : 1连接，转化感受态大肠杆菌XL1? Blue后，用小量碱裂