NV一步法RTPR的一些初探.docVIP

NDV 一步法RT-PCR的一些初探 秦智锋贺东生吴红专娄华杨德威刘福安华南农业大学动物医学系农业部养禽与禽病重点开放实验室(广州天河 510642) 木文对杣収模板RNA的不同方法进行了比较，丼采用RT-PCR 一步法扩增出875bp的H的片 段，通过PCR产物的且接测序，得出其的基因序列；后把目的片段克隆至T easy载体巾，再测序后与 PCR直接测序结果进行比较。并为以后做相应的菽因工程苗打下/菽础本文对抽取模板RNA的不同方 法进行了比较，并采用RT-PCR—步法扩增出875bp的目的什段，通过PCR产物的且接测序，得出其的 基因序列；后把FI的片段克隆至T easy载体中，再测序后与PCR直接测序结果进行比较。并为以后做相 应的基因工程苗打下了基础。 新城疫病毒HN基因RT-PCR 新城疫病毒 HN基因 RT-PCR 新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)是引起鸡的急性败血性疾病。为养倉业的重 耍烈性传染病。NDV属于副粘病毒科，为单股负链(-ss)RNA结构。宥囊膜，囊膜上宥F蛋 白HN蛋白纤突，具冇致病性有免疫原性。F蛋白则负责病毒的融合穿透，HN蛋白使病毒 粒子能够吸附细胞受体m。W内已对F基因和HN基因进行研究并取得了一些进展，如曹殿 军等l2j克隆了我同标准强毒F48E9株的HN基因并进行了测序，贺东生等对F基因进行了测 序，并与大肠杆菌融合表达制备了相应的基因工程［341。本研究对我国的4株NDV地方强毒 株进行了克隆和测序，井对其基因系统发育情况与国外的毒株作了初步的比较和分析，为以 后做相应的基因工程苗打下了基础 一、材料与方法 材料 1.1病毒：采自广东省某地方新城疫病毒(NDV)强毒株，标记为NDV-FS2。 1.2菌种：DH5 a ,本室保存 1.3 质粒：T easy vector 购自 Promega 公司 1.4引物：根据§61^631±巾的强毒株如￥八0丑1＜八的1^序列设计引物，引物跨 度为897bp,并在两个引物5’端引入|A)切酶位点EcoR I和 sal I。引物由上海生工代为合成。引物序列如下： p3： TC GAATTC TGCAGTGTGAGTGCTACT。 Tm3=49°C, Tp3=61.4°C p4： GC GTCGAC CTTGACAACTTTAAAACA。Tm4=41°C, Tp4=55. 6°C 前两个碱基为保护性碱基，GAATTC为EcoRI酶切位，GTCGAC为Sal I的酶切 位点。p3p4跨幅897bp。 RT-PCR Kit 和 EcoR I、sal I 均为 promega 产品 RNA 抽提液:Trizol 为 GibcoBRL 产品 RESNcolumnTM琼脂糖DNA纯化系统：华美公司产品 二、方法 病毒的繁殖 采集广东省不同地方疑为患NDV而死亡的病鸡肝，加适量的生理盐水， 于病料研磨器中研磨。取上清液于EP管中，15 X1000RPM离心lOmin，取中 间层上清液于0.22 um无菌滤器中进行过滤除菌。为保险起见，再加庆大至终 浓度为100U/ml。尿囊腔接种9天龄的鸡胚，收获24hr以后死亡的鸡胚尿囊 液。12X1000RPM离心lOmin，以去除人分子颗粒蛋白。然后分装于EP管 中，0.5ml/管。 器材的处理 1EP管、Tip头的处理: 0. 05%DEPC三蒸水浸泡过夜，高压消毒30 min, 100°C烤箱5hr。 2.2玻璃器皿的处理： 0. 05%DEPC三蒸水浸泡过夜，高压消毒30min，180°(3烤箱2牝1、。 2.3无RNA酶三蒸水的制备： 0. 1%DEPC三蒸水室温放置30hr,高压消毒30min去除剩余的DEPC。 核酸的抽提 3.1常规法抽提模板RNA 取上述尿棄液0.5ml,加入蛋白酶K(10mg/ml)20，10%SDS 100ul，37°C作 用2hr，分别用等体积的饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)、氯仿各抽提一 次，取上层水相加入1/10体积的NaAC(Ph4. 8)和2倍体积的无水乙醇，-20°C 过夜沉淀。16 X1000 RPM离心20min,弃上清。用75%乙醇冼沉淀除盐，30min 后16 X1000 RPM离心lOmin,后用5 P 1无RNA酶的水溶解沉淀。 3.2 Trizol抽提模板RNA 取上述尿囊液0.5ml，加入Trizol 0.5ml，吹打混匀，25°C作用10min,再加 入0. 2ml的氯仿，混匀后25°C作用5min, 14 XI000 RPM离心10min,取上清于 等体积的异丙醇屮室温沉淀30min, 14 X1(K)O RPM离心10min,弃上清后用 75%乙醇冼沉淀除盐,30min后16 XI000 RPM离心