低温冻存HABMSs修复兔颅骨缺损的实验研究.docVIP

低温冻存HABMSCs修复兔颅骨缺损的实验研宄 王富强张继波孔令菊刘建生郑德宇 (辽宁医学院解剖学教研室辽宁锦州12 1001) 】目的：通过深低温冻存自行构建的人工植骨材料多孔羟基磷灰石 (hydroxyapatite ceramic, HA)/ 骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells,BMSCs)修复兔频骨缺损，探讨深低温冻存 (Cryopreservation)方法对保存HA复合植骨材料的可行性，以方便临床使用。方 法：应用无菌培养法获得BMSCs与羟基磷灰石HA复合培养，获得复合植骨材 料培养构成人工植骨材料。应用-80°C保存3个只的HA/BMSCs修复兔颅骨 12mm缺损模型，同时以未行低温冻存的HA/BMSCs及单纯的HA分别为对照 组1和2。在术后第12周进行大体观察、X线观察和HE染色等组织学观察。 结果：BMSCs与多孔HA构建出人工植骨材料，BMSCs在HA表面生存良好。 三组模型在术后12周实验组和对照1组的骨缺损处愈合大部，有成熟骨小梁通 过，有的可见髓腔通畅，塑形较好；对照2组骨痂生成少，骨缺损部分愈合， 塑形欠佳，新骨生成有统计学差异(P值lt;0.05)。结论：低温冻存的复合植骨 材料的骨缺损修复能力与新制作的复合材料几乎一致，没有因为冻存而受到影响。 关键词】骨髓间充质干细胞羟基磷灰石支架材料复合物低温冻存颅骨缺损 】R322-33 】A 】2095-1752(2012)08-0392-03 刖目 临床上，创伤、肿瘤以及感染等疾患引起的大块骨缺损相当普遍，骨缺 损的治疗一直是骨科难题之一［1-2］,国内外学者进行了广泛的实研宄与临床实践。 异种、同种异体、自体及人工合成物质作为修复材料在免疫排斥、材料来源、医 学伦理及继发感染等方面的问题目前尚难消除另［3］。应用组织工程的方法构建 人工植骨材料是修复大面积骨缺损的有效方法，但是根据骨组织工程方法，从设 计、细胞培养等到最后获得组织工程骨需要复杂的过程，体外构建需要一定的时 间，不能满足临床上即刻应用骨缺损修复的要求［4-5】。同吋，随着组织工程研究 的深入，组织工程产品的产业化、市场化的需要使其保存也成为新的研究课题, 探索标准化的保存方法，研究组织工程骨的冇效保存技术对于组织工程开发和临 床应用至关重要［6-8］。在以往的研究中，奋低温保存颅骨骨瓣修复颅骨缺损获得 成功的报道［9】。本研究拟低温保存自行构建的轻基磷灰石（hydroxyapatite，HA）/ 骨髓间充质干细胞（bone marrow derivedmesenchyaml stem cell, BMSCs）修复兔卢页 骨缺损，探讨深低温冻存下的HA支架材料复合物修复骨缺损的能力以及深低 温保存支架材料复合物的可行性。 1.实验材料与方法 1.1实验动物日本大耳白乳兔5只，健康2月龄日本大耳白兔18只， 体重2kg，雌雄不限，由辽宁医学院动物实验中心提供。 1.2实验方法 1.2.1骨髓间充质干细胞的分离培养无菌条件下从1日龄健康乳兔 股骨和胫骨中分离培养BMSCs，用完全培养基（青霉素200u/ml,链霉素 200mg/mg,DMEM,15%FBS）冲洗减去两端骨骺的骨干，所得冲洗液1200r/min离 心10分钟，吸弃上清，所得细胞沉淀以ltimes;106/ml密度接种于培养瓶中, 于37°C、5% C 02条件下的培养箱内进行，72小吋半量换液，以后每2天换液 一次。待细胞相互融合达80%生长面积吋用0.25%胰蛋白酶进行第一次传代培 养。 1.2.2复合植骨材料的构建 取106个BMSCs,约lm I与预先用 DMEM培养液中浸泡24h后的无菌HA柱（直径1.2cm,厚约2mm）共培养7天。 应用扫描电镜观察BMSCs在HA表面的形态、生长状况及胶原分泌情况。 1.2.3复合植骨材料的冻存与复苏 将培养1周的支架材料复合物 移入含冇DMEM保存液（10%DMSO, 20% FBS的DMEM培养基）的冻存管中， 于4°C环境预冷lh后，将冻存管置于-80°C冰箱中保存3个月。3个月后，取出 冻存管，快速置于37°C水浴箱中快速复温至保存液完全融化，置于37°C、5%CO2 饱和湿度条件下培养过夜。将部分标本应用扫描电镜观察BMSCs在HA表面的 形态、生长状况。 1.2.4实验动物造模及复合支架移植 在无菌条件下分别应用冻存后 的复合材料（实验组）、新制备的复合材料（对照1组）和单纯HA （对照2组） 修复兔颅骨1.2cm缺损。术后前3天，连续肌注青霉素80万单位/天，分二 次注射。术后12周处死动物，并进行大体观察、X —线检测和HE染色检测骨 缺损修复水平。 1.3统计学分析 采用SPSS1