甘薯根腐病病原菌rDNA―ITS区序列剖析.docVIP

甘薯根腐病病原菌rDNA―ITS区序列剖析 　　摘要：2011年以来，从湖北省甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]主产区采集了根腐病典型植株，分离得到引起甘薯根腐病的病原菌[茄病镰孢甘薯专化型病菌（Fusarium solani Mart.Sacc.f.sp.batatas McClure，简称VSB）]，并对分离得到的甘薯茄病镰孢甘薯专化型病菌核糖体基因转录间隔区进行测序分析，测序结果显示目的片段长度为526 bp。 　　关键词：甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]；根腐病；病原菌；ITS；序列分析 　　中图分类号：S531 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）20-3946-02 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.20.037 　　Abstract： Since 2011， Pathogenic bacteria of sweet potato root rot disease was separated and purified from Hubei province. The pathogenic bacteria of sweet potato root rot disease was identified by molecular method. The results showed that the length of the target fragment was 526 bp. 　　Key words： sweet potato；root rot disease；pathogenicity；ITS；sequence analysis 　　甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]具有高产、稳产、适应性广、抗逆性强、营养丰富、用途广泛等特点，是中国仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物。甘薯具有良好的适应性、抗逆性、高产性，对中国的粮食安全具有重要保障作用，其不仅营养很丰富，而且具有极强的保健作用。近年来，随着人民生活水平提高，对食品保健的要求越来越迫切，其发展前景十分广阔[1-3]。甘薯根腐病是中国北方甘薯区大田常见的一种真菌性病害。随着薯种调运、南薯北种，长江中下游区域的甘薯根腐病有逐年蔓延趋势。近年来，在湖北省甘薯主产区均发现了甘薯根腐病的危害，一般田块发病后减产15%，危害较严重的达50%，甚至绝收，对甘薯高产、稳产威胁极大[4-6]。传统的植物病原鉴定方法主要是通过显微镜观察，确定病原菌的种属，但是同一病害的病原菌还存在生理小种，在分子水平上才能检测到差异。分子生物学的发展及革命性的变化，使得这种差异得以检测，分子水平检测手段相对于传统鉴定方法，准确性得到极大提高。而以真菌的核糖体基因转录间隔区为靶序列的分子水平检测技术成为研究热点[7]。本研究通过分离纯化根腐病病原菌为样本，以真菌核糖体基因转录间隔区为靶标，采用通用引物获得根腐病病原菌的目标片段，为指导该地区根腐病的防治提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　甘薯根腐病病原菌菌株为2011～2014年在湖北省采集的甘薯根腐病典型病株，分离纯化得到病原菌。 　　1.2 ?验方法 　　1.2.1 分离病原菌 将采集到的甘薯根腐病典型病株清洗干净，用剪刀剪取病健交界处的茎段约0.5 cm，剥去甘薯茎段的外皮清洗干净，然后将茎段放置于超净工作台。用消毒过的刀片切成0.2 cm×0.2 cm的小块，然后将切好的小块放入75%的乙醇溶液中消毒3 min，再转移至5%的次氯酸钠溶液中浸泡3 min，随后取出浸泡好的小块用无菌水冲洗3次，用灭过菌的滤纸吸干小块上的水分，最后接种在PDA固体培养基上，放置于28 ℃的恒温培养箱中培养，观察有无菌丝出现[8]。 　　1.2.2 病原菌纯化培养 当发现病原菌的菌丝长出时，在超净工作台上用灭过菌的挑菌针挑取病原菌的菌丝体，转移至灭菌的PDA培养基上，28 ℃恒温培养箱中培养，观察有无其他杂菌产生。如果PDA培养基上还有其他杂菌，则继续重复上述的操作，直至PDA培养基中仅有根腐病一种病原菌菌丝。 　　1.2.3 病原菌形态学观察 在载玻片上滴一滴乳酸棉兰染色剂，再用接种针挑取菌丝，分散于染色液中，盖上盖玻片放置2 min后，光学显微镜下观察。 　　1.2.4 病原菌基因组DNA的提取 将纯化好的供试根腐病病原菌在PDA培养基上培养1周后收集病原菌的菌丝体，采用CTAB法提取和纯化甘薯根腐病病原菌基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。 　　1.2.5 扩增引物 采用真菌核糖体基因转录间隔区的通用