甜茶果实水提物HPLC剖析及抗氧化性剖析.docVIP

甜茶果实水提物HPLC剖析及抗氧化性剖析 　　摘 要 甜茶果实的水提取物经高效液相色谱检测未发现有山奈酚、槲皮素等甜茶植株中常见的黄酮苷元，但发现含有鞣花酸，测定其含量约为0.58%。采用紫外可见光分光光度法分析了甜茶果实提取物的抗氧化能力，结果表明，甜茶果实提取物具有较强的清除自由基和抗氧化能力，其清除自由基能力和抗氧化能力均比人工合成抗氧化剂BHT强。 　　关键词 甜茶；果实；化学成分；分离纯化 　　中图分类号：S571；S663.2 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）30--03 　　食品添加剂的安全性和毒副作用随着人类生活水平的提高和绿色工业的兴起而越来越受到关注，BHA、BHT、TBQH等常用合成抗氧化剂的使用则越来越受到限制。因此，从天然产物中寻找毒副作用小安全性高的天然抗氧化剂已成为近年来的研究热点。大量研究显示[1， 2]广西甜茶中含有黄酮类和酚酸类天然抗氧化活性物质。广西甜茶（Leaf of Strigose Hydrangea）是蔷薇科悬钩子属植物，是广西特产。陈全斌等[3， 4]从甜茶中分离得到了鞣花酸、黄酮苷元槲皮素和山奈酚。鞣花酸是一种植物多酚类化合物，已有文献报导其可以抗衰老、增加肌体免疫，具有较强的防癌功效，且能抗脂质过氧化、抗诱变及捕捉自由基，是一种亟待开发的天然抗氧剂[5]。陈全斌等已对甜茶植株的根、茎、叶和花中黄酮苷元及鞣花酸含量进行了测定，而整个植株中黄酮及鞣花酸的分布规律、甜茶果提取物抗氧化能力等课题有待进一步深入研究。本文利用高效液相色谱对甜茶果实的水提物进行HPLC分析，采用紫外可见光分光光度法分析了甜茶果水提精制样品的抗氧化活性，并与合成抗氧化剂2、6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）比较。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与材料 　　1.1.1 材料与试剂 　　甜茶果（广西金秀）、甲醇、硫酸、磷酸钠、盐酸、磷酸、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、BHT、二苯代苦味酰自由基（DPPH）、钴酸铵、山奈酚和槲皮素的标准品（中国药品生物制品检定所）；鞣花酸标准品（Sigma-Aldrich）。 　　1.1.2 仪器 　　P200Ⅱ型高效液相色谱仪（大连依利特公司）、HHSⅡ-4型电热恒温水浴锅、722型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、E-52A旋转蒸发仪、BP211D型电子天平。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 HPLC分析甜茶果实水提酸解产物 　　甜茶果水提酸解样品的制备：破碎烘干甜茶果实样品1 g→加入氯仿25 mL回流30 min→过滤→真空干燥滤渣→甲醇30 mL回流1 h→过滤→滤液与10 mL1∶1HCl溶液混合→加热水解1 h→甲醇定容至50 mL待测。 　　甜茶果水提液样品制备：准确称取干燥甜茶果1.020 g粉碎→加入150 mL蒸馏水回流提取3 h→定容至500 mL。 　　黄酮苷元标准溶液的配制 分别配制浓度为0.1563 mg/mL的山奈酚和0.1324 mg/mL的槲皮素标准溶液，然后1∶1混合。 　　0.1 mg/mL鞣花酸标准溶液的配制：鞣花酸标准品10.00 mg→甲醇溶解并定容至100 mL。 　　HPLC色谱条件：Hypersil ODS（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱；流动相V甲醇∶V水∶V磷酸=60∶40∶0.3；流速1.0 mL/min；在波长360 nm处检测黄酮类物质，在波长270 nm处检测鞣花酸；柱温30 ℃；灵敏度0.005；进样20 μL。 　　1.2.2 样品成分HPLC分析 　　分别准确吸取甜茶果水提酸解待测溶液和黄酮苷元标准溶液20 ?L进行HPLC分析，根据保留时间定性方法，以确定甜茶果中黄酮苷元的成分及含量见图1。 　　采用工作曲线法测定甜茶果中鞣花酸的含量。通过外标法测定鞣花酸的质量（μg）和峰面积（mv.min）之间的关系绘制标准曲线，标准样品的色谱图如图2（a）所示，样品色谱图见图2（b）。根据HPLC保留时间定性方法确定图2（a）中t=5.24min处的吸收峰对应物质为鞣花酸。经计算，甜茶果中鞣花酸含量为0.58%。 　　1.2.3 甜茶果水提取物抗氧化性研究 　　甜茶果水提精制样品制备 取干甜茶果100 g→加水（1∶10）煮沸120 min→冷却过滤→浓缩、干燥→深褐色甜茶果粗提物→无水乙醇溶解→过滤→浓缩干燥→黄色精制样品。 　　不同浓度样品的清除DPPH自由基实验：精确称取精制样品，配置浓度为0.2、0.5、0.8、1.2 mg/mL的甲醇溶液；分别取0.2 mL与8 mL0.004%的DPPH甲醇溶液混合，30 ℃恒温水浴条件下反应。每10 min测定一次515 nm处的吸光度直到反应完全；另外，测定各样品溶液