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盐池滩羊肌苷酸含量分子标记初析 　　摘要 根据鸡的腺苷一磷酸脱氨酶1（AMPD1）基因序列设计引物，采用PCR-RF-SSCP技术检测了60只盐池滩羊限制性酶切片段单链构象多态性，并分析了不同基因型与盐池滩羊肌苷酸含量的关系。结果表明：在被测滩羊中检测到了A和B两个等位基因，基因频率分别为0.591 7和0.408 3；产生AA、AB和BB等3种基因型，基因型频率分别为0.350 0、0.483 3和0.166 7。最小二乘分析表明，基因型AB所对应的肌苷酸含量最小二乘均数显著高于基因型AA和BB（P0.05）。 　　关键词 肌苷酸含量；单核苷酸多态性；PCR-RF-SSCP；盐池滩羊 　　中图分类号 S826；Q75文献标识码A文章编号1007-5739（2008）23-0258-02 　　 　　肌苷酸（IMP）是肉类的重要风味物质，它是由腺苷一磷酸（AMP）在腺苷一磷酸脱氨酶的作用下经脱氨作用形成的。肌苷酸之所以鲜味突出，是因为其与谷氨酸钠之间有强烈的正相关，可使谷氨酸钠的鲜味增强数倍，并且对酸味和苦味有抑制作用。当肌苷酸与谷氨酸钠质量比例为1∶1时，其鲜味的强度相当于单一谷氨酸钠的30倍[1]。 　　肌苷酸突出的特点是可被广泛存在于动植物组织中的磷酸酶水解而丧失鲜味。在最具风味的淡水鱼和野生鲤鱼的风味物质成分中，肌苷酸占总核苷酸的60%，而ATP、ADP、肌苷和次黄嘌呤的含量很低。因此，肌苷酸含量高低是衡量肉食品风味物质含量高低的重要指标。大量研究表明，肌苷酸和糖蛋白在水中和脂肪中加热能产生明显的肉鲜味。目前，世界不少国家已将肌肉中肌苷酸的含量作为评价肉类新鲜程度的指标之一。 　　盐池滩羊是滩羊的一个重要地方类群，国内的个别研究表明，滩羊肌肉风味物质含量高于其他一些绵羊品种[2]。本研究以肉味鲜美的盐池滩羊为试验材料，以鸡AMPD1为引物，采用限制性酶切片段单链构象多态性（Restriction fragment single strand conformation polymorphism，RF-SSCP）方法，对羊肉呈味起重要作用的DNA分子基础进行单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）检测，并分析限制性酶切片段单链构象多态性与盐池滩羊肌肉IMP含量的关系，以期为滩羊肌苷酸含量的分子标记辅助选择奠定一点理论和实践基础。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1试验羊 　　从盐池滩羊场待上市肉羊群中随机选择健康的滩羊60只，标记编号，颈静脉采血1mL/只，血样用ACD抗凝，-20℃冻存。使用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，将其溶于TE中，在4℃下保存待测。 　　采血后的60只羊全部屠宰，在宰后30min内取下背最长肌约50g，锡箔包装，立即放入冰箱冷冻，全部采样完毕，立即送实验室进行肌苷酸含量测定。 　　1.2肌苷酸含量测定方法 　　准确称取肉样5g，置于50mL塑料匀浆管中，每个混合样各取2份，加5%的高氯酸溶液15mL，用高速组织匀浆机打成浆状，再用l5%高氯酸10mL冲洗匀浆器，合并匀浆液，3 500rpm离心10min，上清液通过中速定量滤纸滤于100mL烧杯中，沉淀再用15mL高氯酸溶液振荡5min后离心，过滤，再与前期滤液合并。全部滤液用5%和1%的氢氧化钠溶液调节酸碱度，当pH值达到6.5时，将其转至100mL容量瓶中，再用去离子水定容，最后将待测提取液-20℃保存。 　　待测提取液在上机前用高速离心机10 000rpm离心6min，取上清液，采用高效液相色谱法分析肌苷酸含量，并以mg/g肉表示。 　　1.3主要试剂 　　限制性内切酶HindⅢ、TaqDNA聚合酶和dNTPs，均购于北京奥科生物技术有限责任公司。 　　1.4引物设计 　　参照鸡已知的DNA500bp核酸序列[3]设计一对引物Pb，上游引物确切序列为：5′-CAGCTGTGTCCAGCTTGGA-3′，下游引物序列为5′-AAGCAATTTGTCCCTTGGTG-3′，利用该引物对提取的盐池滩羊基因组DNA进行扩增，引物也由北京奥科生物公司合成。 　　1.5PCR扩增 　　反应总体积为25μL。 　　反应成分：10×PCR缓冲液成分为10mmoL/L Tris-HCl（pH 值8.0），50mmoL/L KCl，0.1% Triton X-100，200μmoL/L dNTP，1.5 mmoL/L MgCl2，引物浓度为1.0μmoL/L，1 UTaq DNA聚合酶，50ng基因组DNA。 　　反应条件：95℃热变性5min，然后95℃变性45s、58℃复性1min、72℃延伸1min，循环30次，最后72℃持续延伸7min。 　　1.6PCR