瓠瓜类型砧木遗传作图群体双亲多态性剖析.docVIP

瓠瓜类型砧木遗传作图群体双亲多态性剖析 　　摘要：以耐湿涝瓠瓜类型砧木材料JZS与不耐湿涝材料T2002为遗传作图双亲，利用随机扩增多态性DNA（random amplification polymorphic DNA，简称RAPD）法与瓠瓜及其他近源瓜类简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）进行多态性分析。从供试1 678个RAPD、SSR标记中共筛选到26个多态性引物，其中包括14个RAPD、4个瓠瓜SSR、2个甜瓜SSR、5个黄瓜SSR、1个南瓜SSR，扩增出28个多态性位点。几种标记多态性检测效率不同，瓠瓜SSR引物揭示，双亲多态性比例最高（0.47%），其次是RAPD（0.38%），近源瓜类SSR选择效率最低，仅有0.14%～0.15%。结果表明，尽管瓠瓜作图亲本表型差异大，但分子标记结果显示亲本遗传背景相近；甜瓜、黄瓜和南瓜与瓠瓜亲缘关系远，具有种属特异性的SSR引物在瓠瓜亲本JZS、T2002多态性分析中通用性不高。为了提高分子标记多态性分析效率，绘制高密度遗传图谱，下一步应尽快开展基于基因组测序技术检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）位点的研究。 　　关键词：瓠瓜；砧木；多态性分析；耐湿涝 　　中图分类号： S184 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）11-0048-03 　　我国约有2/3的国土面积存在不同程度的湿涝胁迫，严重影响黄瓜、西瓜和甜瓜等瓜类作物种植生产[1]。瓠瓜[Lagenaria siceraria （Molina） Standl.]根部发达，用作瓜类嫁接砧木，能够增强接穗耐逆性，提高产量[2]。耐湿涝瓠瓜砧木的选育已成为瓠瓜育种的重要目标之一。 　　瓠瓜耐湿涝特性是由多基因控制的数量遗传性状[3]。前期笔者通过集团混合分离分析法（bulked segregation analysis，简称BSA），以不定根数作为鉴定指标，筛选到简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）引物S87/88与瓠瓜耐湿涝性状相关性为0.78，这与瓠瓜耐湿涝特性目的基因尚存在较大遗传距离[4]，影响分子辅助选择的正确性，亟须通过遗传图谱构建和耐湿涝数量性状基因座（quantitative trait locus，简称QTL）定位等手段为瓠瓜耐湿涝分子育种提供紧密连锁分子标记。 　　SSR引物具有种属特异性，瓠瓜基因组研究相对于黄瓜、西瓜和甜瓜等瓜类作物相对薄弱，仅有浙江省农业科学院李国景研究员所在课题组的相关报道[5]，瓠瓜SSR开发数目有限。为此，笔者所在课题组利用随机扩增多态性DNA（random amplification polymorphic DNA，简称RAPD）、瓠瓜SSR及其他近源瓜类SSR，对瓠瓜类型砧木遗传作图双亲（耐湿涝材料JZS与不耐湿涝材料T2002）进行多态性分子标记分析，以期为瓠瓜遗传图谱构建和耐湿涝QTL定位研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　所用材料为瓠瓜类型砧木耐湿涝材料JZS、不耐湿涝材料T2002及其F1代。将种子播种于32孔穴盘中，按常规方法进行田间管理。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 DNA提取 材料播种后，待植株长至5～6张真叶时，每份样品各取10张单株的混合叶片，每株采集1 g嫩叶，于-80 ℃保存。?⒄?CTAB法，提取新鲜叶片总基因组DNA。 　　1.2.2 分子标记分析 甜瓜SSR引物序列由美国威斯康星大学园艺系翁益群教授提供，瓠瓜SSR引物序列由浙江省农业科学院蔬菜研究所李国景研究员提供。RAPD、SSR的混样体系为20μL，包括3.24 μL dNTP（1.25 mmol/L）、1.5 μL 10×buffer、2.43 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.35 μL引物（5 mmol/L）、5 μL DNA（10 ng/μL）、0.05 μL Taq DNA聚合酶（1 U）。RAPD、SSR的PCR产物分别用2%琼脂糖凝胶和高分辨率MS-6琼脂糖凝胶（TaKaRa，上海）水平电泳检测。 　　1.3 数据记录与连锁分析 　　根据相同迁移率位置表现出的差异带型，确定在双亲中显示差异的分子标记，用于多态性分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 RAPD引物在双亲中的扩增和多态性筛选 　　600对RAPD引物分别在双亲JZS、T2002中扩增出4 188、4 197个条带，平均每个引物产生6.99个条带（表1）。筛选到14个RAPD引物（分别编号为P21、P38、P77、P79、P80、P86、P184、P214、P237、P284、P28