雌激素对干细胞移植治疗兔后肢缺血的影响-血管外科专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 摘要 目的：探讨雌激素对干细胞增殖及干细胞移植后组织生长的影响。 方法：原代培养雄性新西兰大白兔骨髓间充值干细胞至第五代，与雌 激素影响下干细胞的生长对照，检测 CD34,44,45。以 3umol/L 荧光 标记的 Brdu 标记细胞 48h，台盼蓝染色观察细胞存活率，以及 Brdu 标记率、培养液中血管内皮生长因子的变化，随后进行干细胞移植， 并观察移植后组织的变化。 结果：在雌激素影响下兔骨髓间充质干细胞生长速度（80%）明显快 于无雌激素组兔骨髓间充质干细胞（60%），雌激素组及对照组干细胞 CD44 均为阳性，CD34,45 均为阴性，普通显微镜下观察两组兔骨髓间 充值干细胞台盼蓝染色着色率均低于 1%，于荧光显微镜下观察兔骨 髓间充质干细胞 Brdu 标记率95%。移植后雄性新西兰大白兔缺血肢 体血供明显改善，兔缺血组织中血管内皮可见 Brdu 标记细胞，表明 新生血管为移植干细胞生成，雌激素组优于对照组， 8mg/d 优于 4mg/d。雌激素组皮温（见表 1）、毛细血管数量及毛细血管数量与肌 纤维比值（见表 2）均优于对照组。 结论：1、雌激素对骨髓间充值干细胞生长有促进作用。 2、雌激素对骨髓间充质干细胞存活率及 Brdu 标记率无影响。 3、雌激素对骨髓间充质干细胞生成新生血管有促进作用。 前言 肢体缺血为血管外科常见病，干细胞移植为挽救肢体坏死最终方 法。目前国内外尚未见雌激素作用于缺血肢体干细胞移植后改善肢体 缺血的相关报道。 本试验将雌激素作用于体外培养的兔骨髓间充质 干细胞，观测兔骨髓间充质干细胞生长速度的变化及测定血管内皮生 长因子的变化，检测雌激素应用于骨髓间充质干细胞移植治疗雄性新 西兰大白兔后肢缺血后，移植组织的变化。旨在证实在干细胞移植治 疗肢体缺血中，雌激素的应用能促进血管生成，进一步改善肢体缺血， 为下一步雌激素的临床应用奠定基础。 第一部分 雌激素对干细胞增殖的影响 材料与方法 （一）实验材料 1.5 月龄雄性新西兰大白兔一只，体重 1.6kg （二）主要试剂： 1、PBS 溶液：NaCl 8.00g，KCl 0.2g，MgCl2.6H2O 0.1g， Na2HPO4.2H2O 1.15g，KH2PO4 0.2g 加蒸馏水定容至 1000ml，调节 PH 值为 7.2-7.4 2、0、25%胰蛋白酶溶液 100ml 胰蛋白酶溶液过滤除菌，分装 后-20℃保存。 3、青霉素、链霉素溶液(鲁抗医药） 4、台盼蓝（美国 Sigma) 5、3%戊巴比妥钠（上海浩然 ） 6、碘伏消毒液（山东康富 ） 7、DMEM 培养液（美国 Gibco 公司） 8、胎牛血清（杭州四季青） 9、鼠抗兔 CD34,44,45 抗体（ 美国 santa cruz ） 10、羊抗鼠二抗（ 美国 santa cruz ） 11、VEGF 抗体（上海西唐生物科技有限公司） （三）主要仪器： 1、1，5，10，20，50ml 注射器 2、酒精灯，吸耳球，无菌吸管，15ml 离心管，1.5ml 离心管，6 空培 养板，25cm2 无菌培养瓶 3、二氧化碳培养箱 4、离心机 5、光学显微镜 6、荧光显微镜 7、电热恒温水浴箱 8、压力蒸汽灭菌锅 9、精密天平 10 无菌超净台 （四）软件： 1、SPSS 2、Photoshop 实验方法 (一)兔 BMSC 的分离与培养 1.普通清洁级雄性新西兰大白兔 1 只，每公斤体重 3%戊巴比妥 钠 2ml 耳缘静脉麻醉，脱毛，消毒。 2、50ml 注射器预抽肝素 12500u/L，股骨远端离断后抽取兔股 骨骨髓间充值干细胞，摇匀混合，注入离心管。 3、2000 转/秒离心 10min，弃上清，加入 1、5mlDMEM 吹打，加 DMEM 至 10ml，同法离心，弃上清，再重复一次。 4、加入含 15%胎牛血清，100u/ml 青霉素和 100u/ml 链霉素的 DM DMEM1.5ml（完全培养液）吹打均匀，转入培养瓶，加入完全培养液 5ml。 5、10 倍倒置显微镜观察后，放入 37℃，5%CO2 培养箱培养。 6、24 小时后倒置显微镜观察，未见污染，半保留换液。 7、3 天后 10 倍倒置显微镜观察，吸出培养液后，加完全培养 液 1.5ml 吹打，洗去血块，加入完全培养液 7ml。 8、每隔 3 天半换液。传代培养至第五代，分为 A、B 两组 A 组 不加雌激素，B 组加雌激素。分别留取两组培养液，-20℃冰箱保存。 9、观察第五代细胞生长至培养瓶 70%左右时加入 3umol/LBrdu 继续培养 48h。 （二）兔 BMSC 及 Brdu 标记率鉴定 1、 制定细胞爬片，PBS 冲洗细胞爬片 3 次，4%多聚甲醛固定 30min,1:200