番茄DR1基因植物超表达载体的构建及其转化番茄的研究-农产品加工与贮藏工程专业论文.docxVIP

西南农业大学硕士学位论文 中文摘要 中文摘要 DR 基因是通过差异显示 PCR 法从番茄中分离的果实成熟新基因，属于生长索反应基因 家族 (AzalIAAs)o DR 基因在果实发育和成熟过程中，其表达受乙烯和生长素的调节，预示 该基因不仅与果实成熟过程相关，并且可能参与生长素与乙烯之间的相互作用.但目前对其 作用机制并不清楚，本论文拟通过在番茄中超表达 DRl 基因研究其对果实成熟和激素信号转 导的影响，从而明确 DRJ 基因作用的分子机理。主要研究内容及结果如下 z 一、物双元超表达载体 pBINI9-DRl 的构建 1、异硫氨酸服·盼氯仿的方法从绿熟番茄果实中提取总RNA; 2、以总RNA 为棋板，体外反转录合成 cDNA ，cDNA 为模板，用高保真 p缸聚 合酶通过 PCR 扩增了全长 DRl 基因t 3、p旬扩增的 DRl 基因与经 Smal 酶切的 pDHSl 载体通过 T4 DNA 连接酶连接， .连接产物转化感受态大肠杆菌，用 PCR 方法筛选阳性菌落，阳性菌落经扩大培 养后提取质粒，该质粒经进一步 PCR 以及酶切鉴定确为重组中间载体质粒，且 外源片断正向插入，命名为 pDH51-DRl; 4、中间载体pDHSI-DRl 经EcoRl酶切获得了包含 3SS 扇动子、 DRl 基因川 35S 终 止子的片段，此片段与经Ec oRI 酶切的 pBIN19 质粒连接，产物转化感受态大肠 杆菌， PCR 筛选阳性菌落，阳性菌落扩大培养提取质粒，该质控经酶切及 PCR 鉴定确为重组植物双元表达载体质粒，命名为 pB1N19-DRlo 二、再生番茄植株的获得 1、植物双元表达载体pBlN19-DRl 通过冻融法转化农杆菌 CSS ，用 PCR 筛选获得 了含表达载体的重组农杆茵茵落，该重组酶落经扩大培养后提取质粒，质粒经 .EcoRI 酶切进一步验证了表达载体已经转入农杆菌: 2、AlisaCring 番茄种子无菌萌发获得无菌菌，切取 O.Scm 下胚轴或 0.4 X 0.6 大小 幼嫩子叶作为外植体: 3、外植体置于芽再生培养基经28C暗室预培养三天，用转化的工程农杆菌液侵染 30min ，置于芽再生培养基28C暗室共培养两天，转入含 500m以..Carb 的抑菌 培养基抑菌培养一周，再在含 SOrnWL Kan 的筛选培养基筛选重组子，重组子 在芽再生培养基中培养约六周后长出抗性芽，此芽经进一步诱根培养再生出完 庭植株。 关键询:DRl 基因超表达载体番茄转化 ? . .2 ‘ 西南农业大学硕士学位论文 英文摘要 --..一- Abstract DRl genes 缸e new fruit ripening genes fromωmaωby differential display PCR， belong to auxin response gene family (AuxlIAAs gene family)..DRl genes are regulated by auxin 缸td ethylene，which means the genes not only are rela饱d to fruit ripening ，but a1so involved in 也e transaction between auxin and ethylene.However，what mentioned above is not cle缸 our research is to investigate the effect of DR1. on 仕uit ripening and hormone signal transduction by over-expression of DRl in tomato，then asce目ain the function of DRl.The main ∞ntents and results 。of 也e experiment as fo1Jows: 。 Construction ofplant binary over-expression vector pBINt9-DRl Total RNA was ab由部ted 衍。m mature-green ωmaω by guanidine 由iocyanate-phenol-chlorofonn me曲。d; Total RNA 臼 template，complement DNA of DRl mRNA was reverse 位anscripted in vi廿0; the cDNA as 始mplate in the following PC