成纤维细胞对人工皮肤黑素瘤模型中MV3生长的影响-皮肤病与性病学专业论文.docxVIP

成纤维细胞对人工皮肤黑素瘤模型中 MV3 生长的影响 【摘要】 专 业：皮肤病与性病学 研究生：王俊玲 导 师：陆洪光教授 目的：在去表皮的真皮（De-epidermized dermis,DED）组织模型的基础上， 观察成纤维细胞（Fibroblasts,FBs）与黑素瘤细胞在不同接种比例下的生长情况， 从而期望在体外寻找 FBs 与 MV3 侵袭性之间的关系。 方法：采用组织块贴壁法处理健康小儿包皮，用10%DMEM低糖培养基进行 FBs原代培养，获得人皮肤FBs细胞；分别将FBs、MV3传至第3代，将FBs和MV3 制成细胞悬液按不同比例（FBs:MV3分别为5：1、3：1:；1:1）接种于培养瓶中 混合培养，同时设MV3和FBs单独培养作对照，观察FBs和MV3的生长情况；制 备人去表皮的真皮（DED）;将培养至第3代的FBs、MV3制成细胞悬液，按3:1、 2:1、1:1的比例接种于DED表面，采用液下培养和空气—液面培养相结合的方式 进行培养，2周后取培养的DED分别行苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin，HE)染 色、行波形蛋白（Vimentin)和S-100、HMB45免疫组化组织双染、以只接种MV3 的DED做阴性对照，并做基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、 基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprot- einase-9，MMP-9）、金属蛋白酶组织抑制 因子-1（Tissue Inhibitor of Metallopro- teinase-1，TIMP-1）免疫组化染色，PBS 为空白对照。 结果：FBs 和 MV3 在 5:1、3:1 接种比例下 FBs 生长占优势，在 1:1 接种比 例下 MV3 生长占优势；HE 染色显示在 3:1 接种比例下 DED 表面未见细胞生长； 在 2:1 接种比例下 DED 表面见细胞呈单层生长,部分管腔可见细胞浸润生长；在 1:1 接种比例下 DED 表面见细胞呈单层生长;2:1 接种比例下行 Vimentin 和 S-100、HMB45 双染均可见细胞周围及管腔红色颗粒沉积;只接种 MV3 的 DED MMP-2、TIMP-1 免疫组化结果均可见棕黄色颗粒沉积在细胞周围。 结论：成纤维细胞对人工皮肤黑素瘤模型中 MV3 的生长起抑制作用。 【关键词】： 黑色素瘤细胞；成纤维细胞；生长 前言 恶性黑素瘤（malignant melanoma）是来源于黑色素细胞的恶性肿瘤，是一 类起源于神经嵴的黑色素细胞恶性肿瘤。发病率为全身恶性肿瘤的1%～2%，其恶 性程度高，预后差，大多数患者在10年内死亡。Markovic等[1]研究显示，MM在癌 症发病顺位上，男性人群中排第5位，女性人群中居第6位。一项日本的研究报道 显示，日本MM的发病率正在逐年增加[2]。我国MM的发病率相对偏低，但是发展迅 速，是我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一。近年来，皮肤恶性黑素瘤（cutan ous malignant melanoma,CMM)发病率呈上升趋势,据临床统计，约有80%以上的 肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移，故此方面的研究一直受到很多人的关注。 人类肿瘤的90%来源于上皮组织，上皮细胞需要在生长信号的不断作用下避 免分化和凋亡，获得无限复制的能力，并依靠新生血管生成、获得侵袭、转移能 力才能最终形成肿瘤。整个过程依赖于肿瘤细胞与宿主间质微环境的相互作用， 遗传学和细胞生物学研究表明，间质细胞可以提供肿瘤细胞生长、增殖信号、并 参与新生血管生成，细胞外基质（extracellular matrix,ECM）重塑更为肿瘤侵 袭和转移所必需[3]。成纤维细胞是组织微环境中主要的间质细胞，也是产生ECM 成分、基底膜和组织蛋白酶的主要细胞。然而目前对于成纤维细胞在肿瘤发生发 展中的作用尚不完全清楚，越来越多的研究表明，细胞间质中活化的成纤维细胞 可以通过旁分泌的方式为上皮转化提供促癌信号，并参与肿瘤血管生成，甚至肿 瘤的进展和转移，成为肿瘤生长的重要调控者[4-5]。近年来有关肿瘤血管生成、E CM及降解ECM的蛋白酶类成为肿瘤微环境研究的热点，然而细胞间质中丰富的成 纤维细胞尚未引起肿瘤研究者的足够重视。不过，现有的一些研究已经表明，成 纤维细胞在肿瘤微环境中的研究有着重要意义和良好前景[6-7]。 以往研究黑素瘤的侵袭主要用动物实验，比如小鼠B16黑素瘤模型[8]。近年 来，本课题组用MV3细胞系成功构建了人工皮肤黑素瘤模型[9]，并在此模型基础 上进行了一系列相关研究。本实验通过在体外对FB和MV3共培养的观察，在人工 皮肤黑素瘤模型上接种人成纤维细胞，以探讨成纤维细胞对人工皮肤黑素瘤模型 中MV3