课件：ELISA质量控制.pptVIP

5.2 室间质量评价（EQA） ? ? EQA 是一种回顾性评价，主要是控制实验室结果的准确性。其要点是保证同一患者的标本一样对待室间质评物，必须强调的是EQA结果必须同IQC一并分析，找出原因，改进工作中的不足，同时指导实验室选择合适的试剂盒。 ? ? 综上所述，ELISA检测操作步骤复杂，可能会影响测定结果的因素较多，分布在测定操作的各个步骤中，因此必须加强各环节的质量控制，才能得到准确可靠的检测结果。 为什么常用酶免试剂空白不加酶 在生化工作中，常做的空白都是除了不加样本外，要用的试剂都要加并且同样本一样的处理，但在免疫工作中酶免试剂的要求空白除不加样本外还不加酶标液，如果我们像做生化一样处理，对酶免的空白也加酶标液，就会发现，空白显色，而且比某些阳性还深，似乎这样处理错了。 以前自己手工包被时，最后一步是加满小牛血清、蛋白液封板的。厂家为了降低成本，把这步省了 但厂家投机并不影响日常样本检测结果，这是因为病人血清中有大量的蛋白，因此有了封板的效果，酶标液的非特异性吸附也就减少了，不会产生假阳性。 但是这样的空白毕竟是不严密的，在定性试验时没有严格的要求，空白不当产生的误差就可忽略了，但在用酶标仪测定是就显出来了，所以，厂家在说明书上有个校正——空白OD不足0.05时以0.05计 。 封板和过度封板影响灵敏度，所以一般厂家都不封板了。很多空白值不对是因为试剂厂家质量确有问题 ELLSA中三种对照的区别 阳性对照作用:监测试剂和反应条件是否合格。加的是待测物质含量特别高的标准血清。 阴性对照作用:一般监测洗涤是否合格（待测抗原抗体结合以外的其他非特异性吸附和交叉反应）。加的是不含待测物质的标准血清。 空白对照：一般加稀释液。空白对照作用:监测底物是否变质，在无酶条件下是否显色，显色应查找原因。提高准确度 酶联免疫吸附试验检测法的质量控制 酶联免疫吸附试验（ELISA）：几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达ng甚至pg水平，达到10-8～10-12g 。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 因其方法学相对简便，灵敏度高，特异性好，经济安全等特点而在临床上广泛应用，但是由于其操作步骤复杂，一般包括试剂准备，样本收集，加样，温育，洗涤，显色，比色，结果判定等，其中任何一项操作不当都会对检测结果产生很大影响。因此，必须加强ELISA检测的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。 影响抗原抗体反应的原因 ?一、反应物自身因素? 不同来源的抗体，反应性各有差异，抗体的浓度、特异性和亲和力都影响抗原抗体反应，为提高试验的可靠性，应选择高特异性、高亲和力的抗体作为诊断试剂。等价带的宽窄也影响抗原抗体复合物的形成，单克隆抗体不适用于沉淀反应。? 抗原的理化性状、分子量、抗原决定簇的种类及数目均可影响反应结果。颗粒性抗原出现凝集反应，可溶性抗原出现沉淀反应，单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。? 影响抗原抗体反应的原因 二、环境条件?? ??(一)电解质? 抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中须有电解?质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物?相互靠拢聚集形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见?反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用?0.85%氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。? 影响抗原抗体反应的原因 ?(二)酸碱度? 蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH?过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质抗原抗体反应一般在pH?为?6～9?进行。? ???(三)温度? 抗原抗体反应必须在合适的温度中进行，一般以?15～40℃为宜，最适宜反应温度为?37℃。某些特殊的抗原抗体反应，对温度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在?4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。? 此外，适当振荡和搅拌也能促进抗原抗体分子的接触，加速反应，其作用与反应物粒子大小成正比。 PBS 磷酸盐缓冲液 一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释,原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用,蒸馏水不具有盐平衡作用,可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用,对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应,所以使用PBS是首选.PBS也不是万能的,有的生物活性物质需要的条件比PBS还要高,就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分,维持最佳