涎腺腺样囊性癌MVD计数与LN、LN-R、VEGF表达的意义.pdfVIP

8 题目：涎腺腺样囊性癌MVD计数及LN、LN-R、VEGF表达的意义 (7)PBS冲洗3×5’，甩去PBS液，每张切片加l滴生物素标记的 7； 第二抗体(试剂C)，室温下孵育15分钟，PBS冲洗3×3 (8)甩去PBS液，每张切片加1滴链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶 液(试剂D)，室温下孵育15分钟，PBS冲洗3×3’； (9)甩去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB显色剂，显色8 分钟； 00)自来水终止显色，苏木素复染，梯度酒精脱水干燥，中性树胶 封片。 用PBS液代替一抗作空白对照，LN、LN．R以同一切片中小血 管壁作阳性对照，VEGF、CD34阳性片购自迈新公司。 2．2原位杂交法： 2．2．1 VEGF寡核苷酸探针的mRNA序列为： AGFGGTCCCAGACCC ACCTCCACCATGCCA 5’．CrCTCT TACCCGCAC把TTGAG CTTCCAGGAG TGGTGGACAT TTAAACGAACGFACTlI把AG．3’； 2．2．2具体操作步骤如下： (1)所有玻片用多聚赖氨酸进行防脱片处理； (2)石蜡切片厚6~8LIm，常规脱蜡至水，3％H202室温(25C)处 理10分钟，蒸馏水洗涤2次； (3)暴露mRNA核苷酸片段：切片滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋 白酶2滴，室温消化30分钟，0．5MPBS洗涤3次，每次5分钟(3 ×5’)，蒸馏水洗涤1次； ． (4)预杂交：每张切片滴加209l预杂交液，恒温箱3TC孵育2小时， 吸取多余液体，不洗； (j)杂交：每张切片滴加209l杂交液，用原位杂交专用盖玻片盖在 切片上，恒温箱40℃杂交过夜； (6)杂交后洗涤：揭掉盏玻片，30℃水温的2×SSC洗涤2次，每 次5分钟；0．5xSSC洗涤一次，15分钟；0．2xSSC洗涤一次，15 分钟； ’ 9 题目；涎躲腙样囊性癌MVD计数及LN、LN-R、VEGF表达的意义 (7)滴加封闭液，37C恒温箱孵育30分钟，甩去多余液体，不洗； PBS (8)滴加生物素化鼠抗地高辛，37。C恒温箱孵育60分钟，O．5M 洗涤4次，每次5分钟； PBS洗涤3次， (9)滴加SABC，37C恒温箱孵育20分钟，O．5M 每次5分钟； PBS ㈣滴加生物素化过氧化酶，37。C恒温箱孵育20分钟，0．5M 洗涤4次，每次5分钟； nUDAB显色：每张切片滴加新鲜配制的DAB液1滴，显色30分 钟， ∞自来水终止显色，苏木素复染，梯度酒精脱水干燥，中性树胶 封片。 用PBS液代替一抗作空白对照，VEGF阳性片购自博士德公司a 3．统计学分析 数据均用SPSSl0．0软件包处理，根据数据类型分别采用t检验、 四格表确切概率法，用Spearman相关分析方法进行相关分析，n =o．05。 0 胚目：涎腺腺样囊性癌MVD计数及LN、LN．R、VEGF表达的意义 判定标准 1．涎腺腺样囊性癌的判定标准参照《口腔组织病理学》(第四版于 世风主编人民卫生出版社2001年第一次出版)：肿瘤细胞由导管 内衬上皮细胞和肌上皮细胞组成，根据其细胞形成的组织结构， 将其分为筛状(腺样)型、管状型、实性型。筛状型中肿瘤细胞 排列呈圆形、卵圆形或不规则形，其中含有大小不等的囊性腔隙， 呈“筛状”：管状型结构由二三列细胞组成，内层为导管内衬上皮， 外层为肌上皮细胞，