粉防己碱纯化、鉴定及其对人血淋巴细胞免疫指标的影响-免疫学专业论文.docxVIP

研究生朱新 研究生朱新锋 遵义医学院硕士学位论文 万方数据 万方数据 粉防己碱纯化、鉴定及其对人血淋巴细胞免疫指标的影响 中文摘要 第一部分 粉防己中粉防己碱的纯化、鉴定 目的：建立高速逆流色谱与柱层析联用分离纯化粉防己中粉防己碱（Tetrandrine， TET）的方法。 方法：采用硅胶柱层析，葡聚糖凝胶柱层析，高速逆流色谱法对粉防己中的粉防己 碱进行分离；采用超高效液相色谱检测其纯度；采用核磁共振氢谱（nuclear magnetic resonance hydrogen ， 1HNMR ）和 核磁共 振碳谱（ nuclear magnetic resonance carbon，13CNMR）确定化学结构。 结果：分离得到一个生物碱单体：粉防己碱，峰面积归一法计算其纯度为 99.3%。 结论：高速逆流色谱与柱层析结合是有效的分离制备粉防己碱的方法。 关键词：粉防己碱；高速逆流色谱法；葡聚糖凝胶柱层析；硅胶柱层析 第二部分 粉防己碱对人血淋巴细胞免疫指标的影响 目的：探究粉防己碱对人淋巴细胞体外培养生长转化的影响，了解粉防己碱的免疫作 用，对粉防己碱的预防性用药做初步的探索与研究。 方法：（1）采用溴化二甲基噻唑二苯四唑法检测终浓度为 1.0μg/ml、1.5μg/ml， 2.0μg/ml，2.5μg/ml 的 TET 对人淋巴细胞增殖的影响，检测终浓度为 50μg/ml， 125μg/ml，250μg/ml 的 PHA 及最优的 PHA 125μg/ml 与不同浓度 TET 混合对人淋巴 细胞增殖的影响，以只加培养液培养的淋巴细胞作为对照，绘制细胞生长曲线。（2） 用瑞氏吉姆萨染色观察细胞的形态变化。（3）采用免疫组化技术检测 IL-10、TNF-α 和 TGF-β 抗体在细胞中的表达。 结果：（1）TET在 1.5μg/ml-2.5μg/ml的范围内显著抑制人淋巴细胞的增殖(F=27.38, P0.05)，呈现明显的剂量依赖性，1.0μg/ml TET对人淋巴细胞的增殖抑制作用差异 无显著性；PHA在 50μg/ml-250μg/ml的范围内显著抑制人淋巴细胞的增殖(F=4.31, P0.05)，呈现明显的剂量依赖性；PHA（125μg/ml）与不同药物浓度的TET显著抑制 5 人淋巴细胞的增殖(F=42.76, P0.05)，呈现明显的剂量依赖性。（2）瑞氏吉姆萨染色 观察细胞形态，结果表明：与单独采用 1640 培养基的比较，TET组、PHA（125μg/ml） -TET组胞核缩小明显，PHA组核质增大明显。细胞形态在二者的干预下变化显著， TET能显著干预PHA对人淋巴细胞的刺激作用；（3）免疫组化观察细胞染色结果表 明，TNF-α、TGF-β1和IL-10 抗体在不同浓度TET作用下细胞中的表达均呈阳性，定位 于T、B细胞的细胞质，在T、B细胞膜上呈阴性表达，在其他细胞呈阴性表达。TNF-α、 TGF-β1和IL-10 组与对照组比较，均有显著差异（FTET=48.79，P0.01；FTET=50.39， P0.01 ；FTET=31.32，P0.01）。TNF-α、TGF-β1和IL-10 抗体在不同浓度PHA作用 下细胞中的表达均呈阳性，定位于T、B细胞的细胞质，在T、B细胞细胞膜上呈阴性 表达，在其他细胞呈阴性表达。TNF-α、TGF-β1和IL-10 组与对照组比较，均有显著 性差异（FPHA=16.43，P0.01；FPHA=51.90，P0.01；FPHA=33.73，P0.01）。TNF-α、 TGF-β1 和IL-10 抗体在PHA(125μg/ml)与不同浓度TET混合作用细胞中的表达均呈阳 性，定位于T、B细胞的细胞质，在T、B细胞膜上呈阴性表达，在其他细胞呈阴性表 达。TNF-α、TGF-β1和IL-10 组与对照组比较，均有显著差异（FTET-PHA=27.49，P0.01； FTET-PHA=95.99，P0.01；FTET-PHA=39.27，P0.01）。 结论:（1）TET 对淋巴细胞增殖有很强的抑制作用； （2）体外培养情况下，人淋巴细胞（主要是 T 淋巴细胞）在 TET 的干预下抑 制 TNF-α 的产生，对 TGF-β、IL-10 产生有促进作用。 关键词：人淋巴细胞；TET；PHA；TNF-α；TGF-β；IL-10 6 Purification and Identification of Tetrandrine and It,s Effect on Immune Parameters of Human Blood Lymphocyte Abstract Chapter 1 Tetrandrine Purification and Identification