肺、体血管平滑肌细胞线粒体的异质性-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE 1 PAGE 1 肺、体血管平滑肌细胞线粒体的异质性 硕士生 黄松苓 导 师 胡清华 教 授 摘 要 第一部分 从肺动脉、股动脉、股静脉平滑肌细胞中提取 线粒体方法的对比 目 的: 对比提取肺动脉、股动脉、股静脉平滑肌细胞（PASMC、FASMC、FVSMC） 线粒体方法的成功率差异。 方 法: 断颈法处死150g左右的SD雄性大鼠，分离肺动脉、股动脉、股静脉血管放 置于冰浴的D-Hank’s液中，在显微镜下去除血管外膜内膜，获得平滑肌层。平滑肌层 放入缓冲液中匀浆，匀浆后加入蛋白酶抑制剂cocktail。匀浆液放入EP管，4℃600g离 心5min，取上清置于另一EP管内，4℃5000g离心10min，所获沉淀即为线粒体。方法 改动：梯度离心时两次离心力改为1000g，10min/10000g，15min；600g，5min/7000g， 10min两种搭配。 结 果: 在三种离心速度搭配的改动中，线粒体提取成功率有显著提高。离心力搭配 为600g，5min/5000g，10min时，成功率为47.4%；离心力搭配为1000g，10min/10000g， 15min时，成功率为50%；离心力搭配为600g，5min/7000g，10min时，成功率为89.8%。 结 论：当离心力搭配为600g，5min/7000g，10min时，提取线粒体的成功率最高。 关 键 词： 血管平滑肌；线粒体 第二部分 肺动脉、股动脉、股静脉平滑肌细胞中线粒体 数量和活性的差异 目 的：1.提取线粒体后对比PASMC、FASMC、FVSMC中线粒体数量的差异。2.用 ELISA测定柠檬酸合成酶（CS）含量间接反应线粒体含量。3.通过对比三种平滑肌细 胞中线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性差异，间接反映三种平滑肌细胞中线粒体活 性的差异。 方 法：1.线粒体的提取：断颈法处死150g的SD雄鼠，取出肺动脉、股动脉、股静脉， 放置于冰浴的D-Hank’s液中，在显微镜下去除血管外膜、内膜，获得平滑肌层。平滑 肌层放入缓冲液中匀浆，匀浆后加入蛋白酶抑制剂，之后匀浆液放入EP管4℃600g离 心5min，取出上清液放入新的EP管，4℃7000g离心10min，所获沉淀即为平滑肌层线 粒体。2.线粒体计数：线粒体重悬于100μL配好的Mito-track-green染料中，放置在37℃ 孵育30min，染色结束后，4℃7000g离心10min，弃去上清，沉淀重悬于匀浆缓冲液， 震荡混匀后4℃7000g离心15min，即获得被Mito-track-green着染的纯化线粒体。取获 得的已染色的线粒体悬液10μL加入细胞计数板，在荧光显微镜下观察并计数数荧光亮 点，之后通过细胞计数板计数得出线粒体悬液浓度。3.蛋白浓度测定：取第一次离心 后所得的上清液40μL测定蛋白含量。线粒体数/蛋白质量=单位质量蛋白所含的线粒体 数。4.柠檬酸合成酶含量的测定：取1步骤中第一次离心后的上清1mL，分为五份，-20℃ 保存，按ELISA试剂盒说明书测柠檬酸合成酶含量。5.琥珀酸脱氢酶活性测定：将提 取的线粒体重悬于100μL组织裂解液，4℃冰浴中裂解1小时，之后4℃120000r/min离心 5min。取40μL上清液测蛋白浓度，50μL上清液测SDH活性。活性测定方法按照试剂 盒说明书操作。 结 果：1.线粒体计数结果：PASMC中线粒体数为2×106个/mg pro（n=5），FASMC中 线粒体数为3.5×106个/mg pro（n=5），FVSMC中线粒体数为5.6×106个/mg pro（n=5）； 三种血管平滑肌细胞线粒体数量存在显著性差异（p＜0.05）。 2. 柠檬酸合成酶含量测定结果：（1）PASMC中CS含量为4.43ng/mg pro、 FASMC中CS含量为8.46ng/mg pro，FVSMC中CS含量为7.23ng/mg pro。PASMC与 FASMC两者间的差异有统计学意义(n=3，p＜0.05)；（2）PASMC中单个线粒体CS含 量为1.99×10-3pg、FASMC中单个线粒体CS含量为1.27×10-3pg、FVSMC中单个线粒体 CS含量为2.40×10-3pg，FASMC与FVSMC两者间有差异(n=3，p＜0.05)。 3. 琥珀酸脱氢酶活性检测结果：FASMC与FVSMC中SDH活性比PASMC中 SDH活性高，FASMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的210.36%（n=6，p＜0.05）； FVSMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的243.45%（n=9，p＜0.05）。 结 论：1.股静脉血管平滑肌中线粒体数量最多，股动脉