稻瘟病菌中3个假定ARF蛋白的功能分析-生物化学与分子生物学专业论文.docx

福建农林大学硕士学位论文 福建农林大学硕士学位论文 PAGE PAGE 10 1 前言 稻瘟病是稻类作物世界性真菌病害，给全世界的水稻带来了毁灭性的威胁， 它在全球 80 余个国家发生，也是我国南北稻区危害最严重的水稻病害之一。稻 瘟病具有传播快、发生范围广、暴发频率高、灾变严重等特点，流行年份，重病 地区一般减产 10-20％，重的达 40-50％，局部田块甚至颗粒无收，而且还导致 稻米品质的下降[1]。 引起稻瘟病的病原是稻瘟病菌，稻瘟病菌作为一种典型的丝状子囊菌，易于 开展遗传分析，在生长发育和侵染致病机制方面有诸多特点，也被作为研究丝状 真菌生长发育和侵染致病机制的重要模式生物。该菌的生活史包括有性和无性两 个阶段，有性世代为 Magnaporthe grisea (Hebert) Barr.，属于子囊菌亚门；无性 世代为 Pyricularia grisea(Cooke)Sacc，称为灰梨孢（=Pyricularia oryzae Cav，称 稻梨孢），属于半知菌亚门。除了能危害水稻，它还能侵染大麦、小麦、粟等禾 本科植物等[2,3]。 在自然界中，稻瘟病菌侵染寄主是一个复杂的过程，包括接触，侵入，扩展 等过程。首先，分生孢子通过空气传播，着落在寄主植物表面，依靠顶端的胶状 物紧粘在植物表面，在有水膜或适宜的条件下，迅速萌发，并形成芽管，芽管继 续分化，顶端勾状体形成并膨大形成附着胞[4,5]；然后，附着胞会发生黑色素化， 在其基础部产生侵入栓，并穿破植物的角质层，在被侵染的细胞中，产生大量的 菌丝体，在植物细胞内和细胞间延伸，最后出现病斑。完成侵染之后，稻瘟病菌 菌丝产生分生孢子梗，从气孔或者直接穿透表皮伸入空气，在分生孢子梗的顶端 形成新的分生孢子，这些新的分生孢子在成熟后又被释放到自然环境中，通过空 气再次扩散到其它寄主的表皮上从而形成重复侵染。此外，稻瘟病菌还能从水稻 的根部侵染，研究发现，稻瘟病菌能在禾谷类作物如大麦、小麦等的根部产生土 传病原真菌根部侵染的病斑[6]，与叶片侵染不同，根部侵染的机理是不一样的。 侵染根部时，分生孢子和菌丝在侵染后不产生附着胞，只在侵染点上通过菌丝的 肿胀，形成类似侵染栓的菌丝，直接穿透细胞而完成侵染[7]。 ARF 家族与功能 G 蛋白与小 G 蛋白 G 蛋白是普遍存在于真核生物中的一个 GTP 结合蛋白家族，根据它分子量 的大小，可以将 G 蛋白分为小 G 蛋白（small GTPases）、异三聚体 G 蛋白 （hetero-trimeric G protein）和其它几种特殊的 G 蛋白[8]。现在研究最多是小 G 蛋白，小 G 蛋白的分子量大小一般在 21 到 30KD 之间，所有的小 G 蛋白都隶属 于 Ras 超家族。在 Ras 超家族中有超过 100 多种蛋白[9]，根据它们的结构，氨基 酸顺序和功能，Ras 超家族可以再分为五个家族，包括了 Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran[10,11]。在真核生物进化的过程中，小 G 蛋白非常保守，在生物的生理过程 中，它们是重要的分子开关，参与了细胞内重要的调节过程，其中 Ras 家族调节 细胞的分化过程[12]，Rho 家族调节肌动蛋白的重组过程，参与了 MAPK 激酶的 细胞信号转导过程[13]，Rab 家族在膜转运过程中起重要作用[14]，Ran 在核孔位置 调控着蛋白和 RNA 分子的运输过程[15]。 ARF 的分类 ADP 核糖基化因子（ADP-ribosylation factor,ARF） 是小 G 蛋白 Ras 超家族 的成员，它的大小为 21-kDa 左右，是一类 GTP 结合蛋白[16]。ARF 普遍存在于 真核生物的细胞中，如酵母、果蝇、拟南芥、人类等等，其结构和功能在进化过 程中高度保守。 人们最初是通过霍乱毒素（cholera toxin）认识 ARF 的。20 世纪 80 年代， 人们发现真核细胞内的一些因子可以增强霍乱毒素 Gs 蛋白 α 亚基的 ADP 核糖 基化作用。1984 年，Kahn 等人首先纯化出这种蛋白，并且，将其命名为 ADP 核糖基化因子或 ARF[17]。随着分子生物学的发展，人们对 ARF 的认识越来越多。 在哺乳动物中，有 6 种 ARF 蛋白，根据其分子量大小，氨基酸序列，基因 结构和系统学分析，可以将 ARF 分为 3 类，第一类，包括了 ARF1、ARF2、ARF3； 第二类，包括 ARF4、ARF5；第 3 类，只有 ARF6[18]。第一类的 ARF 是研究的 最多的，它们是高尔基复合体相关的 GTP 酶，调节囊泡的形成，各由 181 个氨 基酸组成，之间的相似度大于 96%，基因组的内含子和外显子的排列方式相同， 都是由 3 个