枸骨内生真菌抗菌活性成分的分离、鉴定及应用研究 生态学专业论文.docx

H A N G Z H O U N O R M A L U N I V E R S I T Y 硕 士 学 位 论 文 论文题目 枸骨内生真菌抗菌活性成分的分离、鉴定及应 用研究 作者姓名 石 一 珺 指导教师 俞 晓 平 研究员 学科专业 生 态 学 所在学院 生命与环境科学学院 提交日期 2009 年 6 月 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本研究做 过贡献的老师和同学均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 日期：2009 年 6 月 1 日 关于论文使用授权说明 本人完全了解杭州师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他手段保存论 文。 日期：2009 年 6 月 1 日 杭州师范大学枸骨内生真菌抗菌 杭州师范大学 枸骨内生真菌抗菌活性成分的分离、鉴定及应用研究 Ⅰ Ⅰ 摘 要 本论文通过系统筛选，从植物枸骨（Llex cornuta Lindl.）中分离到的一株具有高抗菌活 性的内生真菌，并以此作为研究对象，对该内生真菌进行了种属鉴定，并对其代谢产物中主 要活性成分进行了提取、分离和结构解析；在此基础上研究了主要活性成分的分析检测方法 和抑菌作用，通过紫外诱变选育出高效活性生产菌株，运用随机扩展多态性 DNA（RAPD） 技术对该菌及其诱变体进行 DNA 多态性分析，最后对活性成分的安全性和药效进行了评价。 主要研究结果如下： （1）枸骨内生真菌的属种鉴定：根据形态培养特征和生理生化特征，对照《真菌鉴定手 册》将该内生真菌初步归属为木霉属真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai），将其命 名为哈茨木霉菌株 L。 （2）哈茨木霉菌株L的代谢产物的主要抗菌活性成分：分离纯化得到哈茨木霉菌株L代 谢产物的主要抗菌活性成分，经IR、MS和NMR光谱分析确定为一倍半萜类化合物，英文名 称为：trichodermin，化学名称：4β-乙酰基-12，13-环氧-9-单端孢霉烯。并且建立了该物质 的气相色谱分析方法。 （3）活性物质 trichodermin 的抑菌活性：室内毒力测定结果表明，Trichodermin 对 9 种 植物病原真菌的菌丝生长和 2 种植物病原真菌孢子的萌发均有不同程度的抑制作用。其中对 水稻纹枯病菌[Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk]和黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani Küehn）有较好的毒力，其 EC50 值分别为 0.7071μg/mL 和 0.3253μg/mL；对番茄灰霉病菌 （Botrytis cinerea Pers）和番茄早疫病[Alternaria solani （Ellis et Martin） Jones et Grout.]， 毒力作用次之，其 EC50 值分别为 3.7287μg/mL 和 10.6772μg/mL；对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.niveum）、 菜豆炭疽病菌[Colletotrichum lindemuthianum（sacc. et Magn.）Br. et Cav.]和葡萄炭疽病菌 [Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.]的毒力相对较弱，其 EC50 值分别为 23.4072、 41.6013、33.0261 和 28.6393μg/mL；对水稻胡麻斑病菌[Cochliobolus miyabeanus（Ito Kuribayashi）]的毒力最差（800μg/mL）。对黄瓜枯萎病菌（F. oxysporum f.sp.cucumerinum） 和西瓜枯萎病菌（F.oxysporium f.sp.niveum）孢子萌发的抑制作用 EC50 分别为 2.2209 和 2.2905μg/mL。活体试验结果表明，Trichodermin 浓度为 100mg/L 时，对番茄早疫病（A.solani） 及黄瓜立枯病（R..solani）的保护效果达 97.8%和 98.1%，治疗效果达 96.7%和 97.3%。 （4）Trichodermin 制剂的药效、安全性及毒理学研究：盆栽试验结果表明，Trichodermin 1000 倍液对黄瓜立枯病（R..solani）有良好的治疗和保护作用，7 天后保护防效和治疗防效