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浅议青霉素结合蛋白测定技术 论文关键词】氘标记青霉素结合蛋白聚丙烯酰胺凝 胶电泳荧光放射自显影 论文 】当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床 治疗带来困难，对3 -内酰胺类抗生素而言，某些菌青霉素结 合蛋白（PBPs）改变造成的耐药性，是P -内酰胺类抗生素的 特点。一般细菌的PBPs 当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难， 对卜内酞胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白（PBps）改 变造成的耐药性，是卜内酞胺类抗生素的特点。一般细菌的 P BPs均为胞浆膜上的蛋白质，是细菌致死的靶位。它的 目、位置、亲和力的变化造成与卜内酞胺类抗生素不易结 合而产生耐药性。人们常采用SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳和 放射自显影的方法研宄PBP 放射自显影的方法研宄PBP 谱，以便了解敏感菌和耐药 -H-*的区别。所以，PBPs测定技术是研究压内酸胺类耐药性的 重要手段［1］。的穿透力弱，用一般放射自显影法不能获得 P BPs图谱，需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法” 国内有关PBps测定技术报道甚少，以3H标记者更少，本文 介绍这一技术。 -H-* 1材料与方法 材料 菌种肺炎链球菌31⑻3, 3030 1 （北京药品生物制品检定 所;本室保存菌种。 培养基C+Y培养基，参见文献（2）。 仅器及药品 垂直板凝胶电泳槽（吴县科研仪器厂）；NG — 1型真空凝 胶干燥器（太仓电视机厂）；TGLL — la型台式高速冷冻离心 机（中科院上海生物化学研究所）；843 8 —超低温冰箱（Fo rmaSclenti fi。，美国）；电泳仪DY — 1型（上海医用分析仪 器厂）；丙烯酞胺（Aerylam ide，临海止学厂产）；甲撑双丙烯 酞胺.（big;瑞士产品）；N，N，N，N 一四甲基乙二胺（TEME D,上 海前进农场制剂厂）；3H标记青霉素乙酞呱陡盐（NewE ngiandNucl ear,美国）；x光底片（天津感光材料 厂;KodakDian gnostiefil mX — OmatARl 3X18em） : 2, 5 一二 苯基嗯哇（PP 0,闪烁纯，上海试剂一厂）；月桂酞肌氨酸钠 （Sarkosyl , Sigma）:十二院基硫酸钠（SDs,上海新华化工厂）; 二甲基亚矶（DMso,北京旭东化工厂）。 方法 肺炎链球菌PB Ps样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培 养基37°C过夜培养，次日再移种新鲜培养基中，37°C培养 23h至对数生长期，菌数约为个/ml（CFU/m 1），菌液分装试 管，每管1ml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37°C保 温10m in,在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐2 0万单位 /ml，冷冻离心5000:/mi nlom仇，弃去上清，菌体沉淀用50 以磷酸缓冲液0做成菌悬液，然后加入5 — 10拼一 20%sarko syl, 37°C保温1 Omin使细胞溶解，加入30协一样 品缓冲液，煮沸3min,置室温备用。 聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞 胺凝胶电泳(SDSP AGE)方法。制备凝胶薄片(厚)，凝胶配方: 分离胶(10%) :Aerylamid e:bis (30:) ,Tris (,/l) 5ml, 10%SDS ,蒸馏水，真空搅拌1 0 — 15min除去气体，再加 入TEMED ,浓缩胶(5%):按上述配方依次为，，而，，，和150。 先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝固。次曰加 入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2h。在加样槽内依次分别加 入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60v，至染料 前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至1 20v，走完全 程约需3 — 4h，用考马斯蓝R250染色30 — 4 5min,过夜脱 色。 关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矶(DMSo)处理 30 min,再用新鲜DM So再次处理30而n，20%即。处理2 — 3h，l%甘油和1%乙酸处理lh，将凝胶片贴附在厚滤纸上，使 用凝胶真空干燥器进行真空干燥，将凝胶片和x光底片贴紧， 置于x光射线暗匣内，放超低温冰箱一 70°C使曝光lZwr，将 X光底片显影，定影，冲洗得到TOPS的放射自显影图谱。X光 底片预曝光条件：(1)国产X光底片用照相闪光灯红色滤光 片，加6层红色玻璃纸滤过，X光底片上覆盖6层红色玻璃 纸，距离50cm，闪光灯闪二次；(2)进口 x光底片预曝光用x 光机最小功率100mA4 OkV,距离40em,每张x光底片曝光。 竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧 西林保温3 7°C10min，然后加入饱和量的氛标记青霉素，37°C 保温10 min,再按上述方法继续进行实验。 2结果与讨论 本法测定肺炎链球菌全细胞中pB ps的含量，首先需要