蛋白质分离介质选择（二、配基和基质选择）.PDFVIP

蛋白质分离介质的选择 （二、配基及基质的选择） 蛋白质分离介质选择要同时考虑两方面，一是配基，也就是选择色谱模式；二是选 择基质，包括基质的种类和排阻极限的选择。 根据目标产品与杂质的性质差异选择介质是介质选择的主要依据。选择了介质也就 是选择了分离模式。 目标产品与杂质在分子大小、等电点 pI 、不失活或可逆失活条件下的疏水性、与亲 和配基的作用四种性质上的差异是介质选择的主要依据之一。产品与杂质某方面的性质 有大的差异，就可用来做为分离方法选择的依据。目标产品与杂质分子大小差异大可用 凝胶色谱分离；等电点 pI 差异大可用离子交换色谱分离；不失活或可逆失活条件下的 疏水性差异大可用疏水色谱分离；与某个亲和配基有特异作用的可用亲和色谱分离。 在凝胶色谱、离子交换、疏水和反相、亲和类色谱中，反相色谱一般容易使样品失 活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制备；其他的色谱方法，只要 条件选择合适，都可以得到高的活性回收率，可以用于制备分离。 基质主要有 3 大类：聚多糖，如交联琼脂糖、葡聚糖基质；硅胶和多孔玻璃；有机 聚合物（聚苯乙烯等）。 由于目标产品限定在蛋白质，分子量比较大，用于小分子的小孔填料肯定不能用。 因为，多孔填料的总的表面积，有 90~95%是在孔内，球型填料的球面上的面积只占有 5~10% 。小孔填料的柱容量太小。 大孔硅胶和多孔玻璃，与蛋白质生物相容性差，大孔硅胶价格贵，表面活性基团少， 制备的填料会残留酸性的硅羟基，造成非特异性吸附。大孔有机聚合物疏水性强，与蛋 白质生物相容性太差，不作亲水性处理无法用于蛋白质分离。 交联琼脂糖、葡聚糖基质是最适合用于蛋白质分离的基质材料，这两类材料生物相 容性好，无非特异性吸附，表面有大量羟基，可用于连接配基，制得各种填料。 琼脂糖介质利用琼脂糖热溶液冷却可凝胶化的特点制备成微球，热溶液在冷却时先 形成螺旋状纤维束，最后形成纤维束网状结构，形成的孔的大小（也就是排阻极限）取 决于糖浓度。见下图。 下图是琼脂糖微球的电镜图，显示了其微观结构特征。 琼脂糖微球及其交联后的产品一般叫 4B 、CL4B、4FF 、6B、CL6B、6FF，这些产品 再键合上不同基团得到离子交换、疏水、亲和色谱填料。4B 、CL4B、4FF 制备时的糖 浓度为 4% ，排阻极限为 6 万~2000 万。6B、CL6B、6FF 制备时的糖浓度为 6%，排阻 极限为 1 万~400 万。4B 、6B 耐压低；CL4B、CL6B 耐压稍高一点，仍很低； 4FF 、 6FF 耐压较高，使用压力可到 0.15 或 0.3MPa 。 葡聚糖是线形结构，用环氧氯丙烷交联成球。因糖浓度和交联度不同，得到不同排 阻极限的微球。葡聚糖微球排阻极限范围小些，在使用时不同条件下柱体积会有较大的 变化，已逐渐较少用于离子交换、疏水、亲和色谱，较多用于凝胶色谱。 1．凝胶色谱 蛋白质凝胶色谱介质是一些表面亲水性的多孔微球，主要是使用无配基的交联琼脂 糖、葡聚糖基质介质；其他如改性大孔硅胶基质、改性大孔有机聚合物基质一般用于分 析。理想的凝胶色谱基质在与样品接触部分不应有离子基团，尽可能少的疏水基团。 大家知道，凝胶色谱分离机理是分子量大的能进入胶的大孔，进入浅，流出快；分 子小的进入胶的大孔和较小的孔，进入深，流出慢。 选择凝胶色谱介质要特别注意其排阻极限。下面为琼脂糖、葡聚糖基质凝胶色谱介 质品种及性能表。 凝胶品种 排阻极限 耐压 MPa 应用 生产厂家 琼脂糖 4B/CL4B/4FF 6 万~2000 万 0.008/0.012/0.15 大分子 西安保赛，美国 GE 琼脂糖 6B/CL6B/6FF 1 万~400 万 0.02/0.03/0.3 大分子 西安保赛，美国 GE 葡聚糖 25 1000~5000 0 ．15 脱盐，肽 西安保赛，美国 GE 葡聚糖 50 1000~30000 脱