植物病原检测.DOC

PAGE 上海必优生物科技有限公司 电话：02166051138 传真：021上海必优生物科技有限公司 电话：02166051138 传真：021植物病原检测 试剂盒（SRA） DAS-ELISA，碱性磷酸酶标记物 美国agdia公司 （请仔细阅读英文说明书，中文说明书仅供参考） 所有试剂及微孔板使用前均需回温到25℃ 1. 试剂盒内组分 项 目 500反应孔 1000反应孔 5000反应孔 包被用的抗体 0.25ml 0.5ml 2.5ml 碱性磷酸酶标记物 0.25ml 0.5ml 2.5ml 注意：以上试剂需要在4℃ 96孔微孔板 5 10 50 注意：微孔板可在常温下保存。 2. 操作者应该注意之事项 按推荐的温度贮存试剂以确保其活性 不要长期贮存1倍浓度的缓冲液 应避免试剂直接接触眼睛或皮肤，如不慎接触到试剂，请立即清洗或到医院就诊 实验前后请务必洗手 3. 实验过程 3.1 准备工作 实验前将抗体包被在微孔板上 根据抗体标签上标识的稀释倍数，用1倍的包被缓冲液稀释抗体。混合均匀 请根据使用量来确定抗体稀释液体积 注意：1个反应孔需要100ul的抗体稀释液。1ml的抗体稀释液足够8个反应孔使用，10ml的抗体稀释液够96个反应孔使用。 在聚乙烯材质的容器中制备抗体溶液。（避免抗体黏附的容器上）。抗体溶液准备好后需立即包被，否则抗体可能会部分失效。 抗体稀释液不能存放，配制好后请立即使用。 3.1.1包被抗体 在每个反应孔中加入100ul抗体稀释液 3.1.2孵育 在恒湿箱中，室温下（25℃）孵育4小时或在4 3.1.3洗板 孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出 加入250ul的1倍PBST缓冲液，之后快速倒出，重复4-8次 将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体 3.2 样品的提取及稀释 3.2.1 尽可能选择出现症状的植物组织作为样品，通常将叶片作为ELISA实验的检测样品，其它植物组织也可用于ELISA实验 在1个反应孔中加入多片叶片的提取液会使实验更经济一些，但却降低了实验的灵敏度。如对样品提取有任何疑义请与本公司联系 若用研钵提取样品，在每份样品提取后请彻底清洗研钵，以免造成样品间的相互污染 绝大多数样品，可使用通用样品提取缓冲液。但有些植物（葡萄、蓝莓等）必须使用特殊的提取缓冲液。如对样品提取缓冲液有任何疑义请与本公司联系 3.2.2 样品研磨后，将样品提取液与提取缓冲液以1：10（样品提取液体积：提取缓冲液体积）的比例混合均匀。或以1：10（样品质量：提取缓冲液体积）的比例在提取缓冲液中研磨样品 每个反应孔需要100ul的样品提取稀释液。多准备一些样品提取稀释液以利于吸取 3.3 点样及孵育 3.3.1点样 根据实验设计图表，取100ul样品提取稀释液到各样品孔中 取100ul样品提取缓冲液到缓冲液对照孔中 3.3.2孵育 在恒湿箱中，室温下（25℃）孵育2小时或4 3.4 酶标记物的制备 将ECI缓冲液稀释到1倍 根据酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物加到1倍ECI缓冲液中，混合均匀 根据使用量来确定酶标记物稀释液的体积 注意：1ml的酶标记物稀释液足够8个反应孔使用，10ml的酶标记物稀释液够96个反应孔使用。 酶标记物请在孵板结束前的10分钟内制备完成。 制备过程请使用清洁的、未使用过的移液管。 3.5 洗板、加酶标记物稀释液及孵育 3.5.1 步骤同上 3.5.2加酶标记物稀释液 在各反应孔中加入100ul酶标记物稀释液 3.5.3孵育 在恒湿箱中，室温下（25℃ 3.6 PNP底物的制备 孵育结束前的15分钟制备PNP底物溶液。在室温下用5ml PNP缓冲液（1倍浓度）溶解1片PNP底物片。每片PNP底物片可溶解成5ml的底物溶液，溶解比例为1mg/ml，大约够40个反应孔使用。 注意：请勿直接接触PNP底物片或将底物溶液暴露在强光下，直接接触或强光刺激会在阴性反应孔中导致背景色干扰。 3.7 洗板、加PNP底物溶液及孵育 3. 步骤同上 3.7.2 在各反应孔中加入100 ul PNP底物溶液 3. 在恒湿箱中孵育30-60分钟 3.8 终止反应 孵育结束后，在各反应孔中加入50ul 3M的NaOH终止反应。这一步可以选做 4. 结果 直接用肉眼观察或用酶标仪在405nm波长下测量结果 阳性