环丙沙星胶体金试纸条的制备-临床兽医学专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 庄平 东海水产研究所 研究员 主席 张庆华 上海海洋大学 副教授 委员 陆宏达 上海海洋大学 教授 委员 胡鲲 上海海洋大学 副教授 秘书 2010年6月 答辩地点 东海所 答辩日期 11日  上海海洋大学硕士论文 摘要 环丙沙星(Ciproflxoacin，cIP)作为第三代的氟喹诺酮类药物，具有广泛的抗菌活 性，被普遍地应用在人类疾病的治疗中。由于交叉抗性等原因，环丙沙星在动物可食 用组织中的残留不仅严重威胁了公共卫生安全，成为重大的食品安全隐患，还进一步 影响了农产品的对外出口贸易。目前，CIP被我国被列为禁用渔药，其在美国、欧盟 等国家或地区也被列为重点监控的对象。因此建立快速、灵敏的环丙沙星残留免疫学 检测方法具有重要的现实意义和技术价值。胶体金试纸条作为一种快速、灵敏、不需 要任何仪器的检测技术可作为环丙沙星残留现场检测的重要手段。本实验通过合成环 丙沙星的人工抗原，免疫Balb／c小白鼠采集免疫鼠脾脏细胞，采用杂交瘤技术制备了 环丙沙星的单克隆抗体，并利用得到的单克隆抗体制备了环丙沙星的胶体金试纸条。 采用改进的碳二亚胺法，在4种不同pH值条件下，制备了4种不同偶联比率的 环丙沙星与牛血清白蛋白(BSA)偶联物，通过紫外扫描、SDS—PAGE、TNBS和氨 基酸分析等方法对环丙沙星人工免疫原CIP．BSA进行鉴定。结果表明：在pH为4．3 条件下，CIP．BSA．2的偶联比最高，可达到34：1，利用TNBS测定CIP．BSA-2的偶 联比为33：1。在同一条件下，制备得到的CIP．OVA的偶联比率为12：1。氨基酸分析 显示CIP．BSA．2消耗了BSA表面的ASP、GLU、LEU、LYS这四种氨基酸。质谱分 析表明CIP．BSA．2的指纹肽段质谱出现了BSA的指纹特征肽段，证明了偶联的成功。 利用CIP．BSA．2免疫小鼠，得到的血清效价均为105以上，表明制备得到的CIP—BSA．2 偶联物可以用于环丙沙星人工抗原的制备。 将CIP．BSA．2分别免疫5只小白鼠，加强免疫后获得多抗血清，采用CIP．OVA 为包被原进行血清效价测定，结果表明各血清效价均高于105。选取血清效价最高的 小鼠用于细胞融???。采用杂交瘤技术将脾脏与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合。然后运用 间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性克隆的筛选，利用有限稀释法进行亚克隆， 并从中筛选出2株稳定的分泌抗体杂交瘤细胞株，分别为JY_1和JY-2。最后通过腹 水大量制备抗体，采用辛酸。饱和硫酸铵法纯化获得单克隆抗体。对单克隆抗体的特 性鉴定结果表明：两抗体均为IgG2a型单抗，抗体的蛋白浓度分别为1．348mg／mL、 1．583mg／mL。两抗体的亲和力均能达到109以上，属于高亲和力的抗体。利用JY-l 建立了ELISA的标准曲线，其IC50可达9．83ng／mL，表明抗体灵敏度高，同时JY_1 抗体的特异性良好，仅与恩诺沙星存在交叉反应，与其他待测药物之前均不发生交叉 反应，选取JY-l用于胶体金试纸条的研制。  上海海洋大学硕士论文 通过柠檬酸钠还原法制备得到了胶体金颗粒，通过紫外扫描和电镜扫描对制备得 到的胶体金进行鉴定，结果表明胶体金的粒径大约在25nm左右。利用胶体金标记JY-1 抗体，制备得到胶体金试纸条。对其性质进行鉴定，试纸条的最低检测限为lOng／mL， 仅与恩诺沙星存在交叉反应。样品在4C的条件下，可以保藏6个月。 综上，本实验制备的环丙沙星胶体金试纸条可用于水产品中环丙沙星残留的现场 检测。 关键词：环丙沙星；半抗原；偶联；单克隆抗体；胶体金；试纸条 II  上海海洋大学硕士论文 Abstract T11e third—generation fluoroquinolones of Ciprofloxacin(CIP)which has broad antibacterial activity,was widely used in the treatment of human diseases．Due to its cross-resistances and other reasons，ciprofloxacin residues in edible animal tissue could lead a serious threat to public health security,a maj or food safety problems，and affect the exports of agricultural produets trade．Currently,CIP Was classified as dis