环介导等温扩增体系中生物分子的稳定性及其保护-水产养殖专业论文.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 PAGE PAGE VI 滴加石蜡将添加不同浓度海藻糖（0%和 15%）的 Bst DNA polymerase 大片段酶保存液（10 mM Tris-HCl，1 mM Dithiothreitol， 0.1 mM EDTA，50% Glycerol，0.1% Triton X-100，pH 7.5）封闭在 PCR 管底部，再在其上添加其他 LAMP 反应试剂混合物组分，分析石蜡分隔 和添加海藻糖对 LAMP 反应试剂混合物在不同储藏温度（4℃、25℃、 37℃）下保存后其活性的衰减特征：以相同储存温度下不经任何处理 的 LAMP 体系混合物为对照，4℃下添加石蜡分隔处理使其活性的半衰 期延长了 6.3 倍，达到 99d；将该混合物置于 25℃下，其活性的半衰 期为 67.6d，是对照组的 16.2 倍；37℃储存温度下，其活性的半衰期 为 16d，是对照组的 5.3 倍。该结果表明：对 LAMP 反应试剂混合物进 行石蜡分隔可以延长其在不同温度下的保存时间，海藻糖的添加可以 较显著的增强这种效果。在 4℃和 25℃下储存 3 个月后添加 15%海藻 糖可以使石蜡分隔体系的 LAMP 相对产物量增长 30%以上。 3. 硅藻土固定化对环介导等温扩增反应试剂混合物的保护效果 将硅藻土与 Bst DNA polymerase 大片段酶保存液混匀并加热固 定，再在其上添加其他 LAMP 反应试剂混合物组分，分析硅藻土固定 化及添加不同浓度海藻糖（0%、5%、10%和 15%）的处理对环介导 等温扩增反应试剂混合物在不同储藏温度（4℃、25℃、37℃和 45℃） 下保存后其活性的衰减特征，结果显示：以相同储存温度下不经任何 处理的 LAMP 体系混合物为对照，在硅藻土固定反应试剂混合物的基 础上添加 15%海藻糖可以达到最佳的保存效果，使 LAMP 反应试剂混 合物在 4℃和 25℃储存温度下半衰期分别延长至 277.8d 和 217d，分别 达对照组的 17 倍和 52 倍；在 37℃贮存条件下，硅藻土固定化可以使 反应试剂混合物的半衰期从 3d 延长至 24.8d；此外，硅藻土固定化在 实验中还表现出对 LAMP 反应试剂混合物在极端环境温度下（45℃） 优良的保护性能。 综合以上实验结果我们发现，各种用来维持酶保存液浓度、阻止 外界水分接近 Bst DNA polymerase 大片段酶分子、防止酶分子催化活 性过早激活的手段都可以用来延长 LAMP 反应试剂混合物的保存期 限，提高其储存稳定性。从上述实验结果来看，硅藻土固定化在本文 尝试的三种处理方法中表现效果最佳，不但延长了环介导等温扩增反 应试剂混合物在室温下的储存半衰期，还提高了该混合物的热稳定性； 石蜡分隔 LAMP 反应试剂混合物的表现好于冷冻干燥处理组。 关键词 环介导等温扩增，试剂，Bst DNA 聚合酶，保存，冷冻干燥， 石蜡分隔，硅藻土固定化，海藻糖 The stability protection of biological molecules in Loop-mediated isothermal amplification reagents ABSTRACT With the unique advantages of high sensitivity, equipment independence and rapid procedure, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been extensively developed to detecting various pathogens. The substances of enzyme, dNTP, and other complex organic molecules in LAMP mixture are subjected to a variety of chemical changes under room temperature, even more, many of which are quite unacceptable in the course of storage and transportation. For solving the problem, we systematically analyzed the protective effect during long-term storage of lyophilization, paraffin segregation and diatomite immobilization in the