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环介导等温扩增技术快速检测产气荚膜梭菌的研究-农产品加工及贮藏工程专业论文
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得河北农业大学或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我…间工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。
学位论文作者签名:张拉机 J 签字日期:加10 年 1/ 月川
关于论文使用授权的说明
本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留及使用学位论文的规定,有权保 留并向国家有关部门(机构)送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查(借)阅。 本人授权河北农业大学可以将论文的全部成部分内容编入有关数据库进行检索,可 以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
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签字日期 : )..c)[ 0 年月叫日
导师签名: Y \飞机b
签字日期 : 2.01 0 年 11 月2 1日
摘要
产气英膜梭菌 (Clostridium pe 价ingens)是…种重要的人兽共患病的的原体,广泛 存在于环境中,极易污染食品及食品原料,并且耐高温不易被杀死,可引起典型的食 物中毒和腹泻。在美国,由产气英膜梭躏引胆的食物中毒位居食源性腹泻的第二位。 目前国内检测食品中的产气英膜梭菌仍采用传统的检测方法,操作繁琐、检测时间较 长、灵敏度较低,已经不能满足食品中致病菌快速灵敏的检测需要,因此在临床研究 和食品安全方面,迫切地需要一种快速、灵敏、特异的方法用于产气爽膜梭菌的早期 检测。几年来,细商检测的新型分子生物学技术陆续被报道,如聚合酶链式反应,比 传统的细菌学检测方法高速、特异性强、灵敏度高,但是由于需要昂贵的仪器、繁琐 的电泳操作以及较高的专业技术,该方法不适宜在基层应用。本研究建立了一套 L灿1P技术快速检测产气英膜梭菌的方法,缩短了检测时间,提高了检测方法的灵敏 性。
灿。灿。本课题采用环介导等温扩增技术(Lo op-mediated isothennal ampIification ,LAMP) 检测产气英膜梭菌,灵敏度高,特异性强,检测方法简便,耗时短且检测成本低。针 对产气英膜梭菌 (ATCC 13124) GenBank 中(基因%AY823400)α 毒素金基因保守序 列,运用仕线引物设计软件 (htψs://primerexplor ,町扣A削p3.0.0/index.html) 设计L 引物。对反应时间、反应温度、镇离子浓度等扩增条件进行优化,确定 25 J.1L的L 反应体系为:内寻|物 (FIP和BIP) 各1.2μmollL.,外引物(盯和B3) 各0.2 J.1mollL, 环引物 (LF) 0.6μmo比, 2.5 mmoVLdNTP , lmmol/LM gCh,10xBst DNA聚合酶 反应缓冲液, 8U的BstDNA 聚合酶大片段, 2μLDNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。 LAMP反应过程是首先在 62.C水浴锅中反应20 min ,然后将其放入80.C 水浴锅中,水 浴3min终止反应,通过肉眼观察有无白色焦磷酸筷沉淀,即可判断是否发生了 LAMP 反应。此外,取扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳,观察梯形条带,以证实是否发生 了LAMP反应。
灿。
灿。
为了比较LAMP检测产气英膜梭菌的灵敏度和人工污染检出限,以 PCR方法作对 照。 PCR反应的引物是 LAMP反应的两条外引物(川和 B3) 。结果表明,LAMP检测 产气英膜梭菌的检出限为 2.92x 102 CFU/mL,人工污染产气英膜梭菌的全脂乳的检出 限为15.7 CFU/mLo 采用试剂盒提取 DNA ,从样品处理到报告结果,耗时1 h。对照PCR 耗时3 h ,检测产气英膜梭菌的检出限为2.92x 105CFU/mL 人工污染产气英膜梭菌的 牛奶的检出限为 1.57x 105 CFU/mL LAMP的灵敏度是PCR 的10000倍。
初步研究了5种模板制备方法对 LAMP检测产气英膜梭菌的影响。研究表明 L刷P 方法对制备模板 DNA 的要求不高,采用成本廉价热裂解法抽提 DNA ,可以缩短反应 时间,整个反应可在 1 h 内完成,比传统的生化检验方法减少了 16-27 h 。研究表明 L灿1P将成为可以替代 PCR 的核酸扩增新技术,为快速检测食源性致病商构建了一个 技术平台。
关键词:环介导等温扩增; LA
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