环介导等温扩增技术快速检测普通变形杆菌的研究-微生物学专业论文.docxVIP

摘要 普通变形杆菌(Proteus.vulgaris)是一种食源性致病菌，广泛存在于自然界，存在于污水， 土壤和垃圾中，也存在于人和动物的肠道中，是一种条件致病菌，容易污染肉类和蛋类等动 物性食品，可导致胃肠炎，脑膜炎，败血症等疾病。传统检测变形杆菌属的方法操作繁琐， 检测时间长，至少需要 48-72h。不能满足食品中致病菌快速、灵敏的检测需要。因此需要研 究变形杆菌的检测方法，为日常食品卫生检测提供快速检验的方法。 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称 LAMP)是由日本学者 Notomi 等人于 2000 发明的一种全新的核酸扩增方法。它采用能特异识别靶序列上 6 个位点的 4 条 引物及一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶 (BstDNA polymerase)，在恒温条件(60～65℃)下， 特异、高效、快速地进行核酸扩增。该技术在 1h 内能扩增出 109 靶序列拷贝，扩增产物是一 系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的 DNA 片段的混合物。因其具 有特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点因为其操作简单、快速、特异性高、 成本低等优点，成为可以替代 PCR 的新的核酸扩增技术。 本研究采用LAMP技术建立了快速检测普通变形杆菌的反应体系。该方法针对变形杆菌的 特异基因atpD，用LAMP引物在线设计引物软件设计引物，在Bst DNA聚合酶作用下60℃恒 温反应60min即可完成对变形杆菌 DNA扩增过程。扩增产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。 为确立了最佳反应条件,我们对 Mg2+浓度、反应时间、反应温度、BST 酶浓度等反应 条件进行了优化，建立 LAMP 反应体系。LAMP 反应的总反应体系为 25μL，其中 FIP 和 BIP 为 1.6μ mol/L， F3 和 B3 为 0.2 μ mol/L，其它反应组分终浓度分别为：1.6 mmol/L dNTP， 2.5μL Bst 酶缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH8.8， 25℃)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2mM MgSO4， 0.1% .Triton X-100）， 0.4μL (8U) Bst 大分子聚合酶，1.5μL 目标 DNA，纯水补足 体积到 25μL。将反应混合物在 95℃加热 5min 后放置冰上冷却，在 62℃孵育 60min，然后在 80℃加热 10min 终止反应。 为评价该技术的特异性，我们使用设计的特异引物对 11 株菌分别进行了 LAMP 扩增，结 果表明：只有变形杆菌为阳性结果，其它菌株均为阴性结果。采用 FTA 滤膜制备模板进行 LAMP 反应，其方法的灵敏度分别为 6.4×102CFU/mL。利用 LAMP 技术直接检测人工污染的 肉制品中的变形杆菌，其检出限为 3.6×103CFU/g。实际检测了 45 份样品，用 LAMP 方法检测 变形杆菌的检出率为 88.9%，敏感性为 100%，特异性为 72.7%，符合率为 93.3%，检出时间 为 1.5h。 试验结果表明：本试验所建立的快速检测变形杆菌的 LAMP 检测方法具有较高的特异性 和敏感性，能够满足变形杆菌快速检测的需要。 关键词：LAMP 法；链置换反应；快速检测；变形杆菌 Rapid Detection of Proteus by Loop-mediated Isothermal Amplification Author:Qian xiang yu Major: Microbiology Supervisor: Professor Zhang Wei Abstract Proteus.vulgaris is a kind of food-borne pathogenic bacteria which is generally distributed in the environment, such as in polluted water, soil and also in intestinal tract of human and animal. It is a conditional pathogenic bacteria, usually polluting the animal-derived food, such as meat and egg. It is leading to gastroenteritis, meningitis, septicemia etc. Traditional method for routine detection of Proteus.vulgaris is complex