环介导等温扩增技术快速检测产毒素性大肠杆菌的研究-食品加工与安全专业论文.docxVIP

州川川饨， 州川川饨，h 唰唰州州 。 恻唰恻呼 ， 阳咄咄咱 ， 则川川RJv m川川肉 。 州附mwat- mY 摘要 食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点，产毒索性大肠 杆菌导致的腹泻是公共卫生学上具有熏要意义的人葡共患病之一。为确保食品安全与 食品贸易，需要大力加强食品检验的力度，迫切需要建立快速、灵敏的产毒素性大肠 杆菌的检验方法。环介辱等温扩增(Lo op-mediated isothennal amplification ，LAMP)是 利用 4 条特殊设计的引物和具有链贺换活性的 DNA 聚合酶，在恒温条件下特异、高 效、快速地扩增 DNA 的新技术。该技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操 作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广 泛的应用。 本课题采用 LAMP 技术检测产潜索性大肠杆菌 (Enterotoxigenic Escherichia coli， 览TEC) ，灵敏度高，特异性强，检测方法简便，耗时短且检测成本低。针对产毒索性 大肠杆菌不耐热肠毒素 (heat labile enterotoxin， LT) 基因保守序列为靶序列运用在线 引物设计软件(ht刷://p而nerexplorer.jpl1amp3.0.0/index.html) 设计 LAMP 引物，问时验 证了引物的特异性及可行性。建立了检测 ETEC 不耐热肠毒素基囚的 LAMP 方法。 对反应时间、反应温度、镇离子浓度等扩增条件进行优化，确定 25J.1L 的 LAMP 反应 体系为:内引物 (PIP 和 BIP) 各1.2μM ，外引物(阳和日3) 各 0.2μM，0.5 mM dNTP ， 4mM MgCh， 10xBstDNA 聚合酶反应缓冲液， 7.2U 的 BstDNA 聚合酶大片段， 2μL DNA 模板和用灭菌双蒸水补足体系。 L灿fP 反应过程是首先在 62.C 水浴锅中反应 3伽lin ，然后将其放入80.C水浴锅中，水浴 3min 终止反应，通过肉眼观察有无白色 焦磷酸筷沉淀，即可判断是否发生了 LAMP 反应。此外，取扩增产物进行 1%琼脂糖 凝胶睐，观察梯形条带，以证实是否发生了 LAMP 反应。 为了比较LAMP检测产毒索性大肠杆菌的灵敏度和人工污染检出限，以 PCR方法 作对照。结果表明， LAMP检测|产毒素性大肠杆菌的检出限为 32.9CFU/mL ，人工污 染的生猪肉的检出限为 55C阳侣。采用试剂盒提取 DNA ，从样品处理到报告结果，耗 时lh 。对照PCR 耗时弛，检测产毒索性大肠杆菌的检出限为 3.29xl04CFU/mL 人工 污染产毒索性大肠杆菌的生猪肉的检出限为 5.5xl04CFU倍。 L灿仰的灵敏度是 PCR 的 1000倍。 通过对实际样品进行检测，确定 LAMP 方法敏感性为 100%，特异性为70%，符 合率为 100%。研究表明LAMP 将成为可以替代 PCR 的核酸扩增新技术，为快速检 测食源性致病菌构建了一个技术平台。 关键询:环介导等温扩增技术:食品检测:产毒素性大肠杆菌(巴 TEC); 不耐热肠毒 索(LT)基因。 Study on the Detection of Enterotoxigenic Escherichia coli Using Loop-Mediated Isothermal Amplification Name:Zhou Jinling Major: processing and storage of agriculture production Sup俨isor: 油angwei Abstract Food safety em町genci创 fr叫uently occurred in recent years. To ensure food safety and business，it is rl叫uired to establish a rapid，sensitive Ent缸。toxigenic Escherichia co/i testing method in food realm. A novel nucleic acid amplification method，tenned loop-mediated iso由.ennal amplification(LAMP) ，employs a DNA polymer础。 that have activity of strand displacement DNA syr咄咄s and a set of four specially designed p血ners 由at