环丙氨嗪ELISA检测方法的初步研究-食品科学与工程；食品科学专业论文.docxVIP

摘要 I 摘 要 环丙氨嗪是一种广谱杀虫剂，畜禽体内主要代谢产物为三聚氰胺，其危险性已引 起人们高度关注。环丙氨嗪经饲料摄入畜禽体内后 2-14%的代谢产物为三聚氰胺， 容易引发食品安全事故。本研究拟通过抗原合成、多克隆抗体制备等途径建立快速 的酶联免疫检测方法，主要采用戊二醛桥连法，偶联半抗原环丙氨嗪和载体牛血清 白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA），制备酶联检测的免疫抗原和包被抗原。经紫 外光谱和气相-缚立叶-红外光谱鉴定，在紫外 265nm 波长处得到环丙氨嗪-BSA 吸收 峰；在红外 3350-3300cm-1、1660-1500cm-1 和 1695-1665cm-1 波长处分别得到环丙氨 嗪-BSA 和环丙氨嗪-OVA 特征性偶联吸收峰，证实本次人工合成的这二对抗原均偶 联成功。抗原偶联比计算，免疫抗原和包被抗原的偶联比分别达到 25.9:1、23.1:1， 为进一步制备抗血清或抗体奠定了工作基础，为构建 ELISA 试剂盒制备了必要的人 工抗原。 用免疫原免疫兔子获得了多克隆抗体，间接 ELISA 检测效价，以两倍的阴性血 清 OD 值的阳性血清的稀释度为效价，达到 16000。通过辛酸-硫酸铵二步沉淀法纯 化抗血清，对固相载体、包被缓冲液、包被温度、时间、溶剂等因素的筛选试验比 较，优化了酶联免疫分析的条件。结果表明，用 0.05M pH 9.6CBS 稀释包被抗原， 在 4℃下包被 12h 效果最佳，添加 5％甲醇的 0.01M pH7.4 PBS 稀释抗体，最有利于 抗原抗体反应，最有利于抗原抗体反应。采用优化后的分析条件，用直接竞争 ELISA 方法进行了抗体亲和力和特异性研究。结果表明，抗环丙氨嗪抗体对环丙氨嗪的特 异性较低，IC50 值较高，不能满足残留检测的要求。 环丙氨嗪和蛋白偶联后，三嗪环和环丙氨基的特征结构被蛋白质大分子所掩蔽， 不能被机体很好的识别，是 ELISA 检测灵敏度较低的原因。因此，本论文设计了能 够最大化保留环丙氨嗪结构特征的系列半抗原结构，并对其合成路线进行了筛选和 优化，最终分别以环丙氨嗪、三聚氯氰为起始原料，经琥珀酸化，巯基丁酸化及丁 羟基化合成琥珀环丙氨嗪，2,4-二氨基-6-羟乙胺基-1,3,5-三嗪，经质谱、红外鉴定， 改造成功，最大程度地保留了环丙氨嗪结构特征，为制备对环丙氨嗪、三聚氰胺高 亲和力的抗体，高灵敏度的 ELISA 残留检测方法的建立奠定基础。 关键词：环丙氨嗪；三聚氰胺；ELISA；多克隆抗体；半抗原；化学合成 Abstract II Abstract Cyromazine is an effective and broad spectrum insecticide; its major metabolite in vivo of animal is melamine (2-14%). It can induce food safety accidents. In order to establish an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for rapidly examing residual cyromazine in food, the antibody with high titer and specificity must be firstly prepared. So it was necessary for antibody production to conjugate the hapten (cyromazine) with a carrier protein to synthesize immunogen (antigen). Cyromazine was coupled with carrier protein bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin (OVA) to prepare immune antigen cyromazine-BSA and coating antigen by glutaraldehyde (GA). The complete antigen was identified by Cyromazine-BSA’s ultraviolet absorption peak was at 275 nm; The characteristic infrared absorption spectra of cyromazine-BSA and cyromazine-OVA are 3350-3300cm-1 、 1660-1500cm-1 and 1695-1665cm-1. Confirm the coupl