环境基因组来源糖苷水解酶异源表达与底物催化特异性研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

山东大学硕士学位论文Ⅲ|l|1Ilffll川l||||II||I 山东大学硕士学位论文 Ⅲ|l|1Ilffll川l||||II||I I||I||I|I|删一 Y1 936824 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 ● 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责 任由本人承担。 论文作者签名： 红照 日 期：四I上』：盈 ● 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) ● 论文作者签名： 丞艺 导师签名： 山东大学硕士学位论文 ‘明 ? ? ? 4 山东大学硕士学位论文 山东大学硕士学位论文 目 录 摘 要 ．9 ABSTRACT． 11 ● 缩略词表(A№reviation) 13 第一章 前 言 l 5 1．1木质纤维素生物质结构特征 l 5 1．2木质纤维素乙醇的生产——方法与挑战 17 1．2．1木质纤维素乙醇的生产方法 17 1．2．2木质纤维素乙醇生产面临的挑战 18 1．3从环境基因组中开发酶资源——进展与问题 19 1．3．1从环境基因组中筛选糖苷水解酶的进展。 19 1-3．2潜在问题 20 ● 1．4论文的立题依据与工作思路 2l 第二章环境基因组内切酶的异源表达及密码子使用偏好性分析 22 2．1材料 22 2．1．1菌株、质粒和培养基 22 2．1．2主要试剂 23 2．1．3主要仪器 23 2．1．4主要软件 ．23 2．2实验方法 ．．24 2．2．1糖苷水解酶基因克隆 24 ● 2．2．1．1引物设计和PCR扩增程序 ．24 2．2．1．2基因片段的回收和连接 25 2．2．1．3大肠杆菌转化及重组质粒筛选 25 2．2．2糖苷水解酶的异源大量表达 25 2．2．2．1大肠杆菌表达菌株Rossetta的转化 ．25 2．2．2．2蛋白的诱导表达及SDS．PAGE检测 26 山东大学硕士学位论文2．2．3密码子优化分析 山东大学硕士学位论文 2．2．3密码子优化分析 26 2．2．3．1大肠杆菌B strain密码子使用频率和各氨基酸使用频率的查找 ．26 2．2．3．2待测基因序列中密码子使用频率和各氨基酸使用频率查找 26 2．3结果与分析 。26 2．3．1环境基因组来源内切酶基因初始序列的异源表达 26 2．3．1．1 Umcel5c2在大肠杆菌中的表达 27 ● 2．3．1．2 Umcel5el在大肠杆菌中的表达 28 2．3．2糖苷水解酶的密码子使用偏好性分析、密码子优化及优化后蛋白表达 30 2．3．2．1异源蛋白的密码子使用偏好性分析 30 2．3．2．2密码子优化及优化后蛋白的异源表达 34 2．4本章小结 。36 第三章环境基因组来源糖苷水解酶的纯化及酶学性质初步分析 37 3．1材料方法 37 3．1．1菌株、质粒和培养基 37 3．1．2主要试剂 ．37 ● 3．1．3主要仪器 37 3．2实验方法 37 3．2．1粗酶液的制备及SDS．PAGE检测 37 3．2．2重组蛋白的纯化和保存 38 3．2．3内切酶酶学性质的初步分析 ．38 3．2．3．1最适温度的测定 ．38 3．2．3．2最适pH值的测定 ．．38 3．2．3．3内切酶酶活测定 。39 3．2．4野生型Umcel5c2动力学参数的测定 ．．39 ● 3．2．4．1 Umcel5c2酶促反应动力学类型的确定 39 3．2．4．2 Umcel5c2酶动力学参数的测定 ．39 3．3结果与分析 。40 3-3．1糖苷水解酶的表达纯化 40 3．3．1．1 Umcel5e1可溶性蛋白的表达 40 6 山东大学硕士学位论文3．3．1．2 山东大学硕士学位论文 3．3．1．2 Umcel5c2的表达纯化 40 3．3．2糖苷水解酶酶学性质的初步分析 4l 3．3．2．1 Umcel5c2最适温度的测定 4l 3．3．2．3 Umcel5c2催化底物范围与酶活力测定 42 3．3．3野生型Umcel5c2动力学参数性质测定 ．．43 ● 3．3．3．1 Umcel5c2酶促反应动力学类型的确定 43 3．3．3．2 Umcel5c2酶动力学参数的测定 43 3．4本章小结 一45 第四章第五家族木葡聚糖酶Umcel5c2底物催化特异性的研究 46 4．1材料方