高产雷帕霉素吸水链霉菌的遗传改造和发酵过程优化-生物化工专业论文.docxVIP

㈨III ㈨III I r I II II TI I I f r rl III Y200351 4 直庄重帕鐾塞区坐链鐾菌鲍遗笾达造 盘发醛过猩选丝 论文评阅人l： 评阅人2： 评阅人3： 评阅人4： 评阅人5： 答辩委员会主席： 委员l： 委员2： 委员3： 委员4： 答辩日期： 201 1-3．9 with with strain genetic improvement and subsequent bioprocess． Extemal Reviewers：!堑QnY墅Q坠墨!：呈型i曼巡星!! Anonymous reviewer2 △nQ塾Y堡Q旦墨至丛i星型曼旦．． 』纽Q坠Y堡Q旦墨￡盟i星竖曼丝 △堕Q卫Y堕!Q坠墨!：呈型i曼盟曼￡§ Examining Committee Chairperson： Chen Huanlin＼Professo此JU Examining Committee Members： Cen Peilin＼ProfeSSO此Ⅲ XU Zhinan＼：ProfessorLZⅢ Wu Jun＼Professo此Ⅲ )型鱼坠g￡坠塑I：Q量；墨墨Q苎Z翊【=厦 Date oforal defence： 201 1．3．9 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 致谢 致 谢 弹指一挥间。从我满心喜悦的收到博士研究生录学通知书，到我给厚重的毕 业论文画上圆满的句号，已整整六年多了。期间，我曾在这美丽的求是园里徜徉 过，也曾在这熙熙攘攘的浙大路上奔波过。我想无论是酸是甜是苦是辣，所发生 的点点滴滴都将成为我一生中最美好的回忆! 首先，我要感谢导师岑沛霖教授、徐志南教授，是您们深厚的理论基础、丰 富的实践经验、创新的思维、严谨务实的治学态度、对科研事业的执着追求给我 留下了深刻的印象，让我受益匪浅。您们不仅在论文课题上对我悉心指导，而且 在治学、为人态度上给我树立了很好的榜样。 同时，我还要感谢沈奔教授(威斯康星大学麦迪逊分校)在构建雷帕霉素异 源菌上的贡献、华东制药厂张薇高级工程师在实验中试上的倾力支持，以及师弟 杨冬、沈文和等给我的大力帮助。你们扎实的实验技能、勇于探知的求学精神和 乐观的生活态度，在与你们的交流中使我受益颇多。 最后，我要感谢家人以及我的朋友们对我的理解、支持、鼓励和帮助。我想 学业的完成并不代表学习的终止，相反这是人生又一新旅程的开始。正如古人所 云，路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。 由于时间仓促及自身专业水平的不足，整篇论文肯定存在尚未发现的缺点和 不足。恳请阅读此论文的老师、同学，多予指正，不胜感激! 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 摘要 摘 要 雷帕霉素(Rapamycin)又名西罗莫司(Sirolimus)，是由吸水链霉菌@ hygroscopicus)产生的新型三烯含氮大环内酯抗生素。雷帕霉素除作为免疫抑制剂 外，目前还广泛应用于器官移植、皮肤病、心脏病等领域。本文以实验室保存的 低产雷帕霉素产生菌为出发菌株，通过传统诱变育种技术，结合高通量筛选手段， 辅以培养基优化，大幅度提高了雷帕霉素产生菌的生产能力，并在发酵罐进行了 中试及放大。同时，采用原生质体育种及基因组重排等新技术对雷帕霉素产生菌 进行选育，并初步探索了雷帕霉素的异源合成。 试验首先初步优化了雷帕霉素产生菌的培养基和培养条件，确定了最优的发 酵培养基为：4％葡萄糖，1％甘油，1％黄豆饼粉，0．15％L．Lys，0．5％KEHP04， 0．5％KH2P04，O．5％氯化钠，0．2％硫酸镁，O．15％硫酸亚铁。较优的摇瓶发酵条 件是：摇瓶装液量为20ml／250ml，培养温度为280C，接种后培养5天收获菌体。 在以上最优条件下，原始菌株发酵液中雷帕霉素产量最高可达120mg／L。 为提高雷帕霉素产量，开展了雷帕霉素产生菌的诱变育种研究。首先考察了 紫外线、DES、NTG等不同诱变剂的剂量效应。然后通过单一诱变剂连续诱变、 不同诱变剂交替诱变、不同诱变剂连续诱变等多种诱变方式，筛选到产量为 279mg／L的诱变菌株D7．804，比出发菌株提高了156％。进一步发展了基于96孑L,板 培养的雷帕霉素突变株的高通量筛选新技术，通过对约100，000个单菌落的快速 高效筛选，筛选到高产突变菌株N5632，其最高产量达至U445mg／L。 在以上高产菌选育和摇瓶发酵优化的基础上，开展了在120L发酵罐上的雷 帕霉素发酵的放大研究。结果表明，初始搅拌转速设定为200rpm，在进入产物 合成期后转速升至400rpm，控制整个发酵过程中溶氧不低于10％，雷帕霉素产 量最高达到412mg／L，基本达到了摇瓶发酵的平均水平。在此基础上，开展了采． 用多种补料方式提高发酵水平的