课件：外源基因表达与基因工程药物.ppt

* * * * * * * * * Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 第 四 节 目 的 基 因 表 达 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 克隆基因的表达 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： 1、不宜表达真核基因组DNA； 2、不能加工表达的真核蛋白质； 3、表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 4、很难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞） 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 表达载体YEpI PT的物理图谱 第五节 DNA重组技术在医学中的应用 DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine 一、重组DNA技术的应用 （一）基因文库构建 1、基因组文库构建 2、cDNA文库构建 （二）定点诱变 1、定点诱变技术 2、PCR定点诱变 二、疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。 疾病基因发现的两个典型例子: 脆性X综合征: 脆性X染色体是指在Xq27～Xq28带之间的染色体呈细丝样, 导致其相连的末端呈随体样结构,由于这一细丝样部位易发生断 裂,故称脆性部位（fragilesite）。 Kallmann综合征: 卡尔曼式综合征是一种遗传性疾病，有关的基因为KALIG-1，位于X染色体短臂,表现为性腺发育不全伴嗅觉丧失或减退，本病呈家族性或散发性，男女均可发病，男性发病率为1/10000，女性发病率约为1/50000。 三、生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。 美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。又称DNA诊断 。 四、基因诊断与治疗 （一）基因诊断的概念 基本过程： 区分或鉴定DNA的异常 分离、扩增待测的DNA片断 能正确扩增靶基因； 能准确区分单个碱基的差别； 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; 便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。 标准： （二）基因治疗的概念 定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy) 1. 产前诊断 2. 携带者测试 3.