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课件:外源基因表达与基因工程药物.ppt
* * * * * * * * * Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 重组DNA技术操作过程可形象归纳为: 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因(外源基因) 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装,转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 第 四 节 目 的 基 因 表 达 表达体系的建立: 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 克隆基因的表达 标准:选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足: 1、不宜表达真核基因组DNA; 2、不能加工表达的真核蛋白质; 3、表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 4、很难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 优点:可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点:操作技术难、费时、经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法:磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系(酵母、昆虫、哺乳类动物细胞) 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 表达载体YEpI PT的物理图谱 第五节 DNA重组技术在医学中的应用 DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine 一、重组DNA技术的应用 (一)基因文库构建 1、基因组文库构建 2、cDNA文库构建 (二)定点诱变 1、定点诱变技术 2、PCR定点诱变 二、疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质,而认识疾病的分子机制。 疾病基因发现的两个典型例子: 脆性X综合征: 脆性X染色体是指在Xq27~Xq28带之间的染色体呈细丝样, 导致其相连的末端呈随体样结构,由于这一细丝样部位易发生断 裂,故称脆性部位(fragilesite)。 Kallmann综合征: 卡尔曼式综合征是一种遗传性疾病,有关的基因为KALIG-1,位于X染色体短臂,表现为性腺发育不全伴嗅觉丧失或减退,本病呈家族性或散发性,男女均可发病,男性发病率为1/10000,女性发病率约为1/50000。 三、生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业,并将有望成为21世纪的支柱产业。 美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场,标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止,已有50多种基因工程药物上市,近千种处于研发状态,形成一个巨大的高新技术产业,产生了不可估量的社会效益和经济效益。 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理,在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。又称DNA诊断 。 四、基因诊断与治疗 (一)基因诊断的概念 基本过程: 区分或鉴定DNA的异常 分离、扩增待测的DNA片断 能正确扩增靶基因; 能准确区分单个碱基的差别; 本底或噪声低,不干扰DNA的鉴定; 便于完全自动化操作,适合大面积、大人群普查。 标准: (二)基因治疗的概念 定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因,以纠正或补偿其基因的缺陷,从而达到治疗的目的。 方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy) 1. 产前诊断 2. 携带者测试 3.
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