高剂量叶酸补充孕小鼠与子代结肠EDNRB表达关系在先天性巨结肠症发病机制作用初步探索-外科学(普外科)专业论文.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE 2 PAGE 2 高剂量叶酸补充孕小鼠与子代结肠内皮素受体 B 表达关系 在先天性巨结肠症发病机制作用初步探索 中文摘要 第一部分 高剂量叶酸补充孕小鼠模型的建立及评价 目的 首次在国内尝试用 RHAA 配方建立孕小鼠高剂量叶酸（high-dose folic acid, HFA）补充模型，并对该模型进行评价，以求初步阐明环境因素（高叶酸饮 食）与胚胎发育及个体患某疾病风险之间的关系提供一些前期实验资料。 方法 选用同窝未经产的健康 8-10 周龄的雌性 C57BL/6 小鼠 60 只，体重 18-20 克，按体重排序，随机分成五组，分别用一组低叶酸的 RHHA 配方饲料饲养（0mg FA/kgdiet）三组高剂量叶酸的 RHHA 配方饲料饲养（40,160 和 320mg FA/kgdiet） 另一组正常叶酸的 RHHA 配方饲料(2mg FA/kgdiet)饲养作为对照组。两周后与雄 鼠进行合笼，于怀孕第二十天（孕足日）对孕鼠行剖腹取胎。每周记录体重及摄 食量两次。对动物于实验前、交配前、孕晚期末和胎鼠的血清叶酸浓度进行检测。 并对该模型进行评价及观察不同浓度的叶酸含量膳食对胎鼠生长发育的影响。 结果 1.交配前后，各实验组动物每天平均摄食量、体重的增长量、食物效能 与对照组相比，无显著性差异。可见不同含量叶酸饮食对孕鼠的发育影响不大。 2.与对照组相比，各高叶酸组（40，160 和 320mg FA/kgdiet）和低叶酸组胎鼠的 平均体重和鼻-臀长均小于对照组（p0.05）。可见高、低叶酸饮食均会减缓胎儿 生长。 3.随着添加叶酸膳食剂量的增加，母体及胎儿血清叶酸浓度也随着相应增加，直 止 160mg FA/kg 饲料饮食，动物体内叶酸水平达到最高值。低叶酸膳食组在合笼 前（叶酸限食两周后），动物平均血清叶酸水平（SFA）明显低于实验前，至孕 晚期末动物体内 SFA 下降至最低，达实验前的 37%左右，合笼前的 50%左右（P 0.01）。同时也发现胎鼠 SFA 高于母体。 4.对照组（2mg FA/kgdiet）因膳食中添加叶酸，合笼前 SFA 略高于实验前（P 0.05），至妊娠晚期末 SFA78%左右（P0.01），说明孕小鼠 SFA 水平因生理性 妊娠而明显下降。 结论 用 40-160mg FA/kgRAHH 配方饲料能成功构建孕小鼠高叶酸模型，并发 现该模型仔鼠生长发育减缓。为今后验证环境（高叶酸饮食）是否能够通过表观 遗传学机制诱导子代某些特定基因位点异常甲基化进而调控其基因表达，最终导 致其子代表型变化及个体今后发病风险奠定实验基础。 关键词 模型，叶酸膳食；妊娠毒性；表观遗传学；小鼠 第二部分 高剂量叶酸补充孕小鼠与子代结肠组织 EDNRB 基 因启动子甲基化关系在 HD 发病机制中初步探索 目的 探讨妊娠期间母体饮食中叶酸含量的高低对子代个体 EDNRB/EDN3/ ECE1 信号传导通路基因和ＨＤ表型的影响，了解肠道内环境因素中的高叶酸饮 食因素，在ＨＤ发病机制中的可能作用，以及在ＨＤ预防中的潜在应用价值 方法 选用同窝未经产的健康 8-10 周龄的雌性 C57BL/6 小鼠 50 只，体重 18-20 克，按体重排序，随机分成五组，分别用一组低叶酸（0mg FA/kgdiet）RHHA 配 方饲料饲养，三组高叶酸补充的 RHHA 配方饲料饲养分别为 40,160 和 320mg FA/kgdiet，另一组正常叶酸的 RHHA 配方饲料(2mg FA/kgdiet)饲养作为对照组。 饲养两周后与雄鼠进行合笼，于怀孕末期处死上述不同叶酸饮食环境下出生的子 代小鼠，分别观察上述五组仔鼠发育并取胎鼠的结肠组织观察是否具有ＨＤ表型 并拍照。分别用高效液相色谱-离子肼质谱联用（HPLC-MS/MS），亚硫酸盐测 序（BSP）,实时定量 PCR 和 Western-blot 技术分别对各实验组胎鼠结肠样本基因 组 DNA 甲基化改变情况及 EDNRB 基因启动子区域甲基化模式有无异常进行检 测，并对不同叶酸饮食下出生的子代小鼠血清叶酸水平与结肠组织基因组 DNA 甲基化水平及 ENDNRB 基因启动子甲基化做相关分析，并分析甲基化模式异常 与其表达改变可能存在的联系。 结果 1.分别在 40,160 和 320mg FA/kgdiet 叶酸补充膳食组发现巨结肠表现，发 生率分别为 1/42（2.4%），2/33（6.1%）1/36（2.8%）。 2. 与对照组相比，叶酸缺乏模型动物和高叶酸补充模型的胎鼠结肠组织基因组 DNA 甲基化水平高于对照组，除了叶酸缺乏组外（P＜0.05），其余各组均没有 显著性差异。 3