ApAI介导泡沫细胞内胆固醇流出过程中的相关分子鉴定.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 广东医学院 硕士学位论文 ApoA-I介导泡沫细胞内胆固醇流出过程中的相关分子鉴定 姓名：刘振 申请学位级别：硕士 专业：@ 指导教师：张志珍 201105 ApoA—I介导泡沫细胞内胆固醇流出过程中的相关分子鉴定 ApoA—I介导泡沫细胞内胆固醇流出过程中的相关分子鉴定 中文摘要 【目的】 在动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)发生发展过程中，泡沫细胞的形成 是早期关键性事件。巨噬细胞来源的泡沫细胞形成是动脉粥样损伤形成的特征表 现。促使胆固醇从巨噬细胞中外流对阻止泡沫细胞形成以及防止动脉粥样硬化的 发生和发展具有重要意义。胆固醇以囊泡转运进行分泌已经得到公认，而在此过 程中有高密度载脂蛋白-I(apolipopfotein，apoA—I)的介导，SCAMP2和YKT6 是囊泡分泌蛋白，参与囊泡分泌转运，那么在apoA．I介导的巨噬细胞源性泡沫 细胞内胆固醇流出过程中是否有这两种蛋白的参与，目前未见报道。本研究首先 建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型，采用高效液相色谱(HPLC)检测ap0A．I介 导泡沫细胞内胆固醇流出的变化，在此皋础上分析在apoA．I介导的细胞内胆固 醇流出过程中，SCAMP2和YKT6表达的变化，鉴定在此途径中是否有SCAMP2 和YlT6参与。 【方法】 1．人单核THP．1细胞用含lO％胎牛血清的RPMI．1640培养液培养，佛波 酯(PMA)诱导人单核THP．1细胞，使其分化为巨嘴细胞，然后加入乙酰化低 密度脂蛋白(ac．LDL)，使巨噬细胞进一步诱导为泡沫细胞，建立巨噬细胞源性 泡沫细胞模型。 2．臣噬细胞源性泡沫细胞经多聚甲醛固定，油红O染色，加苏本精复染， 十相差显微镜卜．观察，对巨噬细胞源性泡沫细胞模型进行签定。 3．细胞分为巨噬细胞组、泡沫细胞组和加apoA．I处理的泡沫细胞组，分 别收集各组细胞和培养基，并分别提取胆固醇，以胆固醇标准品为对照，高效液 相色谱法(HPLC)检测各组的胆固醇含量，计算胆圃醇流出率。 4．细胞培养诱导成泡沫细胞后，根据SCAMP2和YlT6基因在GenBalll【 中的序列设计、合成引物，通过RT-PCR半定量和Real．time PCR定量方法，分 别分析巨噬细胞、泡沫细胞和印oA．I处理的泡沫细胞中SCAMP2和YKT6基 因表达。5 因表达。 5．Westem blotting方法分析巨噬细胞、泡沫细胞和加apoA-I处理的泡沫 细胞中SCAMP2和Ⅵ(T6蛋白表达。 【结果】 1．经油红。染色鉴定，成功建立了巨噬细胞源性泡沫细胞模型。 2．高效液相色谱法(HPLC)检测显示，加入印oA．I介导了泡沫细胞内 胆固醇的流出，其流出率变化为5．9％。 3．RT-PCR、Real．time PCR分析表明，与对照泡沫细胞相比，加入ap0A- I后泡沫细胞内SCAMP2基因表达量分别增加1．18倍和1．7倍；YKT6基因表 达量分别增加1．2倍和1．9倍。 4．Wbst锄blotting分析证实了在apoA-I介导泡沫细胞胆固醇流出过程 中，与acLDL组相比，SCAMP2和Ⅵ汀6蛋白表达量分别增加1．2倍和1．6倍。 【结论】 在apoA．I介导的泡沫细胞内胆固醇流出过程中，囊泡转运蛋白SCAMP2 和Ⅵ汀6基因和蛋白表达都有升高，首次证实了囊泡转运蛋白SCAMP2和YKT6 可能参与了ap0A．I介导的泡沫细胞内胆固醇转运过程。 【关键词】 SC√蝴P2；YKT6；囊泡转运；泡沫细胞；胆固醇流出 2 RelatiVe RelatiVe molecular identilfication during apoA-I—mediated cholesterol efnux f}om f．oam ceHs Abstract 【objective】 Maa∞phage f0姗ation is the key eVent d嘶ng generation锄d development in amerosclerosis dise嬲e．Fomation of macrophage-defiVed f0锄cells is charaCt嘶stic of aⅡlerosclerosis plaque．Promoting cellular cholesterol efnu)【is importam to inhibit f0锄cen formation锄d a也erosclerosis．1t is generally acc印ted that choleSterol is secrctcd by meanS of Vesicle仃ansponation，while印oA—I can mcdiate cholesterol emuX舶