高迁移率族蛋白B1在肝纤维化发生发展中的作用及其机制的分析-内科学(传染病)专业论文.docxVIP

山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 I I 高迁移率族蛋白B1在肝纤维化发生发展中 的作用及其机制的研究 摘 要 目的： 通过观察高迁移率族蛋白B1( High mobility group box protein 1，HMGB1)对肝星状细胞 （Hepatic stellate cell，HSC）的激活，以及RAGE在其激活过程中的作用，探讨HMGB1对 HSC的激活作用及其相关机制，为肝硬化的防治提供思路和实验依据。 方法： 第一部分实验：HSC复苏后，加DMEM培养液于37℃、5%CO2孵箱中培养，待铺满80%后 用0.25%胰酶消化，传代2次至对数生长期用于实验。调整细胞浓度为2~5×105/ml，转至6 孔细胞培养板，每孔1ml培养液，继续培养，细胞单层融合达80%后，换无血清的DMEM 培养液孵育2h，使培养细胞均处于G0期用于实验。实验分为三组：第一组：对照组（DMEM 培养液1ml）；第二组：HMGB1刺激组（HMGB1 0.1ug/ml）；第三组：HMGB1抗体组（加 HMGB1抗体20ug/ml培养2小时后+HMGB1 0.1ug/ml）。培养24小时后，采用免疫组化法检 测HSC的α-SMA和TGF-β1的表达，ELISA法检测细胞培养上清液中HA、PIIIP、CIV和 TGF-β1的含量。 第二部分实验：复苏后的HSC置于DMEM培养液中，放在 37℃、5％CO2孵箱中培养， 待细胞融合 80％后，以 0.25％胰蛋白酶消化传代，以传至第二代的细胞用于实验。实验分 为三组：第一组：(A)对照组（DMEM培养液 1ml）；(B)HMGB1 刺激组（HMGB1 0.1ug/ml）； (C)抗RAGE+HMGBl组（加RAGE抗体 20ug/ml 2 小时后＋HMGB1 0.1ug/ml）；第二组：(A) 对照组（DMEM培养液 1ml）；(B)HMGB1 刺激组（HMGB1 0.1ug/ml）；(C)sRAGE+HMGBl 组（sRAGE 20ug/ml和HMGB1 0.1 ug/ml 混合 2 小时后加入细胞DMEM培养液中）；第三组： (A)对照组（DMEM培养液 1ml）；(B)HMGB1 刺激组（HMGB1 0.1ug/ml）；(C)AGE+HMGB1 组（加AGE160ug/ml 2 小时后＋HMGB1 0.1ug/ml）。培养 24 小时后，采用免疫组化法检测 HSC中α-SMA和TGF-β1 的表达，ELISA检测细胞培养上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1 含量。 结果： 1. HMGB1 对HSC有显著的激活作用：免疫细胞化学结果显示，对照组HSC未刺激时 α-SMA、TGF-β1 在细胞质中微弱表达；HMGBl刺激 24h后α-SMA、TGF-β1 较对照组表 达明显增加(P＜0.05)；加入HMGB1 抗体后，α-SMA、TGF-β1 在细胞质中表达水平与对 照组比较无显著差别(P＞0.05)，但较HMGB1 组比较显著下降(P＜0.05)。未刺激时，细胞 培养上清液中HA，PIIIP，CIV和 TGF-β1 含量较少；HMGBl刺激 24h后HA、PIIIP、CIV 和TGF-β1 含量均较对照组明显增加(P＜0.05)；加入HMGB1 抗体后，HA、PIIIP、CIV和 TGF-β1 含量与对照组无显著差别(P＞0.05)，但较HMGB1 组明显下降(P＜0.05)。 II II 2. RAGE 抗体能抑制 HMGB1 对 HSC 的激活作用：免疫细胞化学结果显示，在抗 RAGE+HMGBl组，HSC细胞质中的α-SMA、TGF-β1 表达水平较HMGB1 组明显减少(P＜ 0.05)；ELISA结果显示，抗RAGE+HMGBl组培养液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1 含量较 HMGB1 组显著下降(P＜0.05)；抗RAGE+HMGBl组的免疫细胞化学和ELISA结果虽均较对 照组有所增高，但差异无统计学意义(P＞0.05)。 3. sRAGE可拮抗HMGB1 对HSC的激活作用：免疫细胞化学结果显示，在sRAGE+HMGBl 组，HSC细胞质中α-SMA、TGF-β1 表达水平较HMGB1 组明显减少(P＜0.05)；ELISA结 果显示，sRAGE+HMGBl组培养液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1 含量较HMGB1 组显著下 降(P＜0.05)，sRAGE+HMGBl组的免疫细胞化学和ELISA结果虽均较对照组有所增高，但 差异无统计学意义(P＞0.05)。 4. AGE无阻断HMGB1 对HSC的激活作用：免疫组化结果显示，在AGE+HMGB1 组HSC细 胞质中的α-SMA、TGF-β1 表达较HMGB1 组比较有所增