基于广谱单克隆抗体的有机磷农药多残留免疫检测方法研究硕士学位.docVIP

题目 基于广谱性单克隆抗体的有机磷 农药多残留免疫检测方法的研究 A Dissertation Submitted to Northwestern Polytechnical University for the Master Degree Development of Immunoassays for Multiple Residues of Organophosforus Pesticides using Monoclonal Antibodies Author: Su Jing Specialty: Biomedical Engineering Supervisor: Prof. Xue Xiaoping Tutor: Dr.Yang Hui Faculty of Life Sciences Northwestern Polytechnical University Xi’an Shaanxi, P. R. China March, 2009 摘要 西北工业大学硕士学位论文 摘要 西北工业大学硕士毕业论文 PAGE II PAGE I 西北工业大学硕士学位论文 摘要 PAGE I 摘 要 近几十年来，有机磷农药(Organophosphorus Pesticides, OPs)在农业及畜牧业中得到广泛应用。与此同时，由农药残留引起的食品安全问题也越来越受到人们的关注。 仪器分析法是对有机磷农药残留检测中最经典、最常用的技术，主要采用色谱方法，包括：薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱－质谱联用（GC－MS）和高效液相色谱－质谱联用（HPLC－MS）等技术。这些传统的方法具有灵敏可靠的优点，但是，它们也存在一些明显的不足：成本高、需要昂贵的仪器设备和专业的分析人员，样品准备程序复杂，并且不利于现场操作。因此，迫切地需要建立一种简单、快速、灵敏、价廉，并能够适用在实验室和现场进行大批量的检测和筛选试验的检测技术。免疫检测法是基于抗原抗体特异性识别和结合反应的是一类新的快速、敏感。简便的检测方法，能够满足以上要求，从而日益受到人们的重视。 传统的农药残留免疫检测技术只针对某一种特定的农药残留进行分析。本文基于实际应用中常采取多种农药混合搭配使用的特点，以与原药母体结构密切相关的类似物作为通用性半抗原，将通用性半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联，分别合成免疫原和检测抗原，免疫小鼠，制备、筛选出一种能识别一类或几类具有相似结构的有机磷杀虫剂的广谱性鼠源性单克隆抗体（mAb），以达到对多农药残留同时检测的目的。 本研究中所制备的抗有机磷组特异性单克隆抗体的效价为1×106（间接ELISA实验），参考工作稀释浓度为1:16000。利用间接竞争性ELISA法对几种有机磷农药：乙基毒死蜱、甲基对硫磷、辛硫磷和三唑磷的标准品进行检测，绘制出竞争抑制曲线。结果表明：由于农药化学结构的不同，检测灵敏度有一定的差别；其中对乙基毒死蜱检测灵敏度较高，最低检测限（LOD）为4 ng/mL，对甲基对硫磷的LOD为63 ng/mL。而辛硫磷和三唑磷的化学结构与半抗原差别较大，检测敏感度低、一致性差。 胶体金免疫层析技术（Gold immunochromatography assay, GICA）是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。该方法无需精密检测仪器以及专业的实验操作人员，可以在很短的时间内完成现场检测。它的原理是：以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫结合反应，层析过程中形成的免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），运用可目测的标记物(胶体金)能够直观的观察检测结果(显色条带)，也可以借助专用检测设备判读检测结果。 本文在已制备出抗一类有机磷农药的组特异性单克隆抗体的基础上，又通过鞣酸—柠檬酸三钠还原法制备出直径16.08±0.64nm、质地均一的胶体金，并且以此标记单克隆抗体，组装胶体金免疫层析检测板，从而快速地对上述有机磷农药进行检测。结果表明：该检测板对乙基毒死蜱具有较好的检测灵敏度，LOD为：4 μg/mL，检测时间为5分钟。最后，利用酶免疫检测法和胶体金免疫层析检测板对