组化3第三是章酶组化.ppt

第三章 酶组织化学方法第一节概述 酶是生物体内具有催化作用的特异性蛋白质，细胞内新陈代谢的合成和分解的生物化学反应都有酶的参与，因此，又称其为生物催化剂。 组织化学中的酶反应是指在一定的条件下，使组织细胞内的酶通过作用于酶的底物，使后者被分解形成某种初级反应产物，这种产物被捕捉剂所捕获而沉淀于原位上，然后将这种沉淀物变成具有可见性的最终产物，从而间接证明酶的定位。 酶组织化学反应中注意事项 在制备标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活性，又要保存好组织细胞的形态结构，以保证酶在组织细胞中准确定位。 酶反应的温度、时间、PH必须控制好。 试剂的浓度配制必须准确。 所用器皿必须清洁，以防污染及出现假阳性。 必须做阳性或阴性对照试验。 (二)???反应原理： ? ALP在有激活剂（Mg 2 +）存在和PH9.4时，将其磷酸盐底物（如β一甘油磷酸钠、α一苯酚磷酸钠）分解产生甘油钠和磷酸离子，后者被孵育液中的氯化钙所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，但为非金属盐，需要加入硝酸钴，从而生成无色磷酸钴沉淀，再通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴。 （二）反应原理 显示酸性磷酸酶，先将切片放入含有酶底物（ β-甘油磷酸钠 ）的溶液（PH5.0）中孵育，底物经酶水解，释放磷酸，用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅，沉淀于酶存在的部位，再用硫化铵处理，磷酸铅被置换形成粗颗粒状的黑色硫化铅沉淀物，便可用光镜看到。 （二）反应原理 底物经酶水解，用金属离子捕捉生成的磷酸离子而形成沉淀。即：腺苷－５ˊ－磷酸＋水 腺苷＋磷酸。 根据ATP酶对激活剂、抑制剂的不同反应，以及超微定位观察，生物体内主要有三种三磷酸腺苷酶（ATPase）。 1、膜ATP酶：又分为Na+、K+激活 ATPase 和Mg2+激活ATPase； 2、肌球蛋白ATP酶：又称Ca2+激活 ATPase，因为它可被Ca2+激活； 3、线粒体ATP酶：由Mg2+激活的ATPase （三）光镜显示方法 1、Mg2+激活的三磷酸腺苷酶铅法 （1）原理：ATP酶分解ATP释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，通过形成硫化铅沉淀显色。最适pＨ值为7.2。 （2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷钠盐 5mg 0.2M Tris-盐酸（Tris-HCl buffer） 4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 0.1M MgSO4 1ml 蒸馏水 4.4ml 配制时Pb(N03)2 要逐滴加入，并随时搅拌，使充分混合至无色或淡乳白色。 （1）方法与步骤： ① 新鲜组织,冰切片； ② 入孵育液，恒温37℃孵育20~40分钟 ③ 蒸馏水洗； ④入1%硫化胺1分钟; ⑤流水洗； ⑥甘油明胶封固。 (4)结果: 酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。 (5)对照: ①除去底物，则反应为阴性；②以?－甘油磷酸钠代替底物，显示染色反应为碱性磷酸酶的定位。 2、Ca2+激活的三磷酸腺苷酸 钙-钴法（肌球蛋白型ATPase Padykula和Herman 1995） （1）原理：此法类似碱性磷酸酶的钙-钴法，但底物改用三磷酸腺苷钠盐，最适pＨ值为9.0，对Mg2+型ATPase起抑制作用。 （2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷钠盐 60mg 0.1M巴比妥钠 4ml 蒸馏水 2ml 0.18M CaCl2 2ml 2,4－二硝基苯酚