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组化3第三是章酶组化
第三章 酶组织化学方法第一节概述 酶是生物体内具有催化作用的特异性蛋白质,细胞内新陈代谢的合成和分解的生物化学反应都有酶的参与,因此,又称其为生物催化剂。 组织化学中的酶反应是指在一定的条件下,使组织细胞内的酶通过作用于酶的底物,使后者被分解形成某种初级反应产物,这种产物被捕捉剂所捕获而沉淀于原位上,然后将这种沉淀物变成具有可见性的最终产物,从而间接证明酶的定位。 酶组织化学反应中注意事项 在制备标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活性,又要保存好组织细胞的形态结构,以保证酶在组织细胞中准确定位。 酶反应的温度、时间、PH必须控制好。 试剂的浓度配制必须准确。 所用器皿必须清洁,以防污染及出现假阳性。 必须做阳性或阴性对照试验。 (二)???反应原理: ? ALP在有激活剂(Mg 2 +)存在和PH9.4时,将其磷酸盐底物(如β一甘油磷酸钠、α一苯酚磷酸钠)分解产生甘油钠和磷酸离子,后者被孵育液中的氯化钙所捕获,在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀,但为非金属盐,需要加入硝酸钴,从而生成无色磷酸钴沉淀,再通过硫化铵处理,形成棕黑色硫化钴。 (二)反应原理 显示酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物( β-甘油磷酸钠 )的溶液(PH5.0)中孵育,底物经酶水解,释放磷酸,用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应,形成微细的磷酸铅,沉淀于酶存在的部位,再用硫化铵处理,磷酸铅被置换形成粗颗粒状的黑色硫化铅沉淀物,便可用光镜看到。 (二)反应原理 底物经酶水解,用金属离子捕捉生成的磷酸离子而形成沉淀。即:腺苷-5ˊ-磷酸+水 腺苷+磷酸。 根据ATP酶对激活剂、抑制剂的不同反应,以及超微定位观察,生物体内主要有三种三磷酸腺苷酶(ATPase)。 1、膜ATP酶:又分为Na+、K+激活 ATPase 和Mg2+激活ATPase; 2、肌球蛋白ATP酶:又称Ca2+激活 ATPase,因为它可被Ca2+激活; 3、线粒体ATP酶:由Mg2+激活的ATPase (三)光镜显示方法 1、Mg2+激活的三磷酸腺苷酶铅法 (1)原理:ATP酶分解ATP释放出来的磷酸离子被铅离子捕获,通过形成硫化铅沉淀显色。最适pH值为7.2。 (2)孵育液的配制: 三磷酸腺苷钠盐 5mg 0.2M Tris-盐酸(Tris-HCl buffer) 4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 0.1M MgSO4 1ml 蒸馏水 4.4ml 配制时Pb(N03)2 要逐滴加入,并随时搅拌,使充分混合至无色或淡乳白色。 (1)方法与步骤: ① 新鲜组织,冰切片; ② 入孵育液,恒温37℃孵育20~40分钟 ③ 蒸馏水洗; ④入1%硫化胺1分钟; ⑤流水洗; ⑥甘油明胶封固。 (4)结果: 酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。 (5)对照: ①除去底物,则反应为阴性;②以?-甘油磷酸钠代替底物,显示染色反应为碱性磷酸酶的定位。 2、Ca2+激活的三磷酸腺苷酸 钙-钴法(肌球蛋白型ATPase Padykula和Herman 1995) (1)原理:此法类似碱性磷酸酶的钙-钴法,但底物改用三磷酸腺苷钠盐,最适pH值为9.0,对Mg2+型ATPase起抑制作用。 (2)孵育液的配制: 三磷酸腺苷钠盐 60mg 0.1M巴比妥钠 4ml 蒸馏水 2ml 0.18M CaCl2 2ml 2,4-二硝基苯酚
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