内蒙古农业大学生物说化学与分子生物学实验教学中心.pptVIP

DNA 重 组 实验原理 实验仪器 实验步骤 实验试剂 注意事项 实验原理 外源DNA 与载体分子的连接就是DNA 重组，这样重新组合的DNA 叫做重组体或重组子。重组的DNA 分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2+、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA 分子进行连接。DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体DNA 连接酶和大肠杆菌DNA 连接酶。两种DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA 分子连在一起的功能，而且T4 噬菌体DNA 连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4 噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅助因子ATP 形成酶-AMP 复合物；然后，酶-AMP 复合物再结合到具有5 ’磷酸基和3 ’羟基切口的DNA 上，使DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。 DNA 重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP 处理克服。 连接反应的温度在37 ℃ 时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12 - 16 ℃ ，连接12 - l6h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体诸惧有一段大肠杆菌β 半乳糖苷酶的启动子及其编码。肤链的DNA 序列，此结构称为lac Z基因。lac Z基因编码的α肽链是β 半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146 个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β 半乳糖苷酶分子。lac Z基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β 半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β 半乳糖苷酶，可以用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）显色测定出来，它能将无色的化合物X-gal 切割成半乳糖和深蓝色的底物(5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lac Z基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β 半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β 半乳糖苷酶，在IPTG （异丙基硫代β半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal 的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA 片段插人到位于lac Z 中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β 半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β 半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。 实验仪器 1． 恒温水浴器 2 ．恒温培养箱 3 ．台式离心机 4 ．低温离心机 实验试剂 １．KAc：10g ２．X-Gal（20mg/ml）5ml：需X-Gal 0.1g、 5ml N,N-二甲基甲酰胺、 　　　　　　　　　　　　　锡箔纸数张 ３．IPTG(50mg/ml)2ml： 需IPTG 0.1g ４．LB培养基（1000ml液体＋2000ml固体）： 胰蛋白胨 30g 酵母提取物 15g NaCl 30g 琼脂粉 30g 0.1N NaOH（调pH）需固体NaOH 2g 实验步骤  （一）质粒DNA 的制备 （二）制备重组DNA 1 ．在灭菌的Eppendorf 管中，加人pUC19 质粒l μL ( 2 μg /μL ) , 2 μL 酶切缓 冲液，l μL (2U) EcoRI 酶，无菌双蒸水15μL ，至反应混合 物总体积为 20μL ，离心混匀，37 ℃ 反应3h （酶及缓冲液应放在冰上）。 2 ．在另一无菌Eppendorf 管中，加入DNA 1 . 5μg ，加人lμL 酶切反应液，l μL (2U）及EcoRI酶，无菌双蒸水补到10μL , 37