基于ISSR分子标记的南方红豆杉的遗传特征研究及其SSR文库的构建-生态学专业论文.docxVIP

基于 ISSR 分子标记的南方红豆杉的遗传特征研究 及其 SSR 文库的构建 摘 要 南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)又称美丽红豆杉，为我国特有的第三 纪孑遗植物，是红豆杉属(Taxus)中分布最广的植物种类之一。由于其含有抗癌活 性成分紫杉醇，使其成为重要的药用植物。主要分布于长江流域以南各省区、南 岭山脉山区以及河南、陕西、甘肃等省的山地或溪谷。本研究主要采用核基因简 单重复序列区间(ISSR)分子标记，探讨南方红豆杉的遗传结构和遗传多样性，并 构建了 SSR 文库，旨在为制定南方红豆杉遗传保育策略并实施有效保护和利用 提供理论依据。主要研究结果如下： 1.南方红豆杉 ISSR 分析结果 通过对 11 个省市 20 个南方红豆杉种群的 320 个个体的 ISSR 标记检测，结 果显示：南方红豆杉在物种水平上：PPL 为 91.20%，Nei’s 基因多样性为 0.3331， Shannon′s 信息指数为 0.4954，在种群水平上：PPL 为 62.36%，Nei’s 基因多样性 为 0.2189，Shannon′s 信息指数为 0.3264，种群和物种水平上均具有较高的遗传 多样性，且种群水平遗传多样性低于物种总遗传多样性。同时，20 个种群的物 种总基因多样性(Ht)为 0.3331，其中种群内平均遗传变异(Hs)为 0.2189，Nei′s 基 因分化系数(Gst)为 0.3428，即表明总的遗传变异中有 34.28%来自于种群间， 65.72%来自种群内，种群内的分化明显。分析认为：南方红豆杉的遗传多样性主 要分布于种群内，原因可能与其生活史类型和交配系统有关。 根据 Nei′s 遗传距离进行 UPGMA 聚类分析，将南方红豆杉 20 个种群分成 了两大支，该结果与先前研究的结论有差异。从整体和分组上对遗传距离和地理 距离的相关性进行 Mantel 检测发现：在整体物种水平上，遗传分化和地理距离 呈中度相关(r2=0.2247, P0.01)；在分组水平上，第一组遗传分化和地理距离呈中 度相关(r2=0.1840, P0.01)；第二组遗传分化和地理距离不具有相关性(r2=0.0955, P0.05)。分析认为，南方红豆杉的分布区地形复杂，海拔差异大，分布地区有 众多高山峡谷，南方红豆杉的基因流因此受到一定的阻碍，从而导致南方红豆杉 种群的遗传分化和地理距离呈现中度相关性。 2.红豆杉属 SSR 引物在南方红豆杉中的应用 采用正交试验和单因素试验，建立并优化了南方红豆杉 SSR-PCR 反应体系。 结果表明，南方红豆杉 SSR-PCR 反应的最优结果为 15μL 反应体系中模板 DNA 为 (50ng·μL-1)0.2μL ， Mg2+ 为 (25mM)1.2μL ， dNTP 为 (10mM)0.1μL ，引物为 I (10μM)0.2μL，Taq 聚合酶为(5U·μL-1)0.1μL。 将红豆杉属植物中已公布的30对具多态性的微卫星位点的引物序列用于在 南方红豆杉物种中进行转移扩增，实验结果表明：30对引物中仅1对能扩增出具 有多态性的条带。由此得出，红豆杉属其他物种的SSR引物在南方红豆杉中的应 用效率极低，其引物跨物种扩增不足以用于分析南方红豆杉的遗传多样性。 3.南方红豆杉微卫星富集文库的构建 本研究共筛选出224个阳性克隆，测序结果表明：其中189个克隆含有(CA)n、 (AG)n等重复5次以上的微卫星序列片段，其中完全型92个，占48.7%；不完全型 69个，占36.5 %；复合型28个，占14.8 %。南方红豆杉微卫星序列中的优势类型 是(CA)n，此外还富集到了(GGC)n、(CACT)n、(GAGT)n、(ACAG)n等类型的微卫 星。同时，南方红豆杉基因组还含有许多小的不连续的(TG)n，散在分布在100~200 bp的范围，这些富含(TG)n的区域即为TG岛，研究这些特殊结构的功能有着重要 的意义。 关键词：南方红豆杉；ISSR；基因流；遗传多样性；微卫星 II Genetic analyses of Taxus chinensis var. maitei based on ISSR and construction of its microsatellite library Abstract The plant of Taxus chinensis var. mairei, also named Taxus mairei, is one of the most widerly distributed species in the genus Taxus. The species is of high medicinal value becaus