细胞死亡调控基因GRIM19重组腺病毒构建及在恶性胶质瘤CHG-5细胞中的表达.docVIP

细胞死亡调控基因GRIM19重组腺病毒构建及在恶性胶质瘤CHG-5 细胞中的表达 ＊姚声涛1 , ＊黄 轶2，3 , 曾昭淳2 , 唐文渊1 1重庆医科大学附一院神经外科, 400016；2 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室, 重庆　400016；3 重庆医科大学附属儿童医院临床分子医学中心,重庆 400014) [摘要]　目的　构建细胞死亡调控基因GRIM19 (Genes associated with retinoid-IFN-induced mortality 19) 重组腺病毒载体，观察GRIM19对病毒包装细胞是否具有细胞毒作用，并验证其对脑胶质瘤CHG-5细胞的感染效率。方法　采用PCR方法分别将GRIM19以及EGFP基因亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV, 在BJ5183（pAdeasy）菌内同源重组,筛选阳性克隆,酶切测序鉴定,线性化后转染293T细胞进行包装、扩增, 纯化，PCR检测病毒上清，TCID50法测定病毒滴度并感染CHG-5细胞后Western 免疫印迹法验证GRIM19蛋白表达。结果 连接重组后经酶切和测序法筛选出pAd-GRIM19; 转染293T包装细胞，观察到绿色荧光蛋白(GFP) 明显表达，细胞生长状态良好，未见明显细胞毒作用。Ad-GRIM19及Ad-EGFP初纯病毒经氯化铯梯度离心纯化最终获得约5×1010U /mL与8×1010U / mL滴度的重组病毒;将其体外感染胶质瘤CHG-5细胞，均能达到90%左右的感染率，Western 免疫印迹法表明Ad-GRIM19感染组GRIM19蛋白表达明显升高。结论　成功构建了携带GRIM19基因的重组腺病毒，为体内外进一步研究GRIM19对脑胶质瘤的作用奠定了基础。 [关键词]　GRIM19; 腺病毒,胶质瘤细胞，CHG-5； 中图分类号 R651.1 文献标识码 A Construction of Recombinant GRIM19 gene Adenovirus and its Expression in glioma cell CHG-5 YAOShen-tao1 , HUANG Yi 2,3 , TAN Wen-yuan1, ZENG Zhao-chun2 1、Department of Neurosurgery; the First Affiliated Hospital; Chongqing University of Medical Sciences Chongqing 400016 2、Department of Biochemistry and Molecular Biology; Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University; Chongqing; China; 3、Center for Clinic Molecular Medicine of Children′s Hospital ,Chongqing Medical University，Chongqing; China [Abstract]　Objective　To construct the adenoviral recombinant plasmid bearing the GRIM19 gene, to observe the cytotoxic effect of the GRIM19 gene on the viral packaging cells and to evaluate the expression of GRIM19 in human CHG-5 glioma cell line in vitro. Methods The ＊并列第一作者，同等贡献者 作者简介:姚声涛(1968 - )，男，贵州省遵义市人，汉族，博士研究生，副主任医师，研究方向：颅内肿瘤，发表文章10余篇，电话E-mail:zhuyf1027@163.com。 通讯作者： 唐文渊，电话: GRIM19 and IRES2EGFP gene were respectively subcoloned into pAdTrack-CMV plasmid, and after confirming by restriction enzyme digestion and sequencing，the recombinant plasmid of pAdTrack-CMV-GRIM19 was linearized with PmeⅠand trans