粘孢子虫孢子期扫描电镜样品制备方法的比较.docVIP

PAGE PAGE 1 文章编号： 粘孢子虫孢子期扫描电镜样品制备方法的比较收稿日期： 收稿日期： ； 修回日期： 基金项目： 作者简介：路菊（1964—），女，安徽安庆人，高级实验师，主要从事扫描电镜方面的研究。电话：023路菊1 张全中2 陶忠芬1 李飞1 （1第三军医大学基础医学部：中心实验室，重庆，400038；2重庆市动物生物学重点实验室，重庆师范大学，重庆 400047） 摘 要：本文探讨粘孢子虫成熟孢子扫描电镜样品制备新方法。通过常规方法和改进方法制备粘孢子虫孢子扫描样品，可以看出改进方法后观察结果显示虫体脱落少，结构清晰，立体感强，能够达到了理想的效果。经过改造后的方法，解决了粘孢子虫在制作扫描电镜样品时的几个问题，是一种切实可行的方法，值得推广应用。 关键词：粘孢子虫；扫描电镜；样品制备；比较 中图法分类号：Q959.115 文献标识码：A 粘孢子虫是寄生于淡海水鱼的一大类原生动物寄生虫的统称，种类多、体型小。通常应用光镜观察形态来进行分类，光镜放大倍数低，景深差，无立体感，一些细微结构不易看清，如碘泡虫体壁上的“鞘”和“条纹”结构 [1]。因此，可以用扫描电镜做为分类的一种辅助手段，来弥补通过光镜下观察虫体形态这一经典分类的不足。在国外应用扫描电镜对粘孢子进行分类的比较多[2，3]；国内一般还是通过光镜观察来进行分类，一方面是因为电镜设备价格昂贵，另一方面是样品制备方法对于非专业人员来说难以完成的。作者在研究碘泡虫超微结构的过程中，应用扫描电镜对其表面形貌进行观察，以瓶囊碘泡虫（Myxobolus ampullicapsulatus Zhao et al, 2008）[4]为例介绍粘孢子虫孢子扫描电镜样品制备的常规方法和改进方法并比较了两种方法的成像效果。 1 材料与方法 1.1 材料： 寄生有瓶囊碘泡虫的病鱼于2007年8月购于重庆陈家湾菜市场，鳃组织中有很多孢囊，内含大量成熟的瓶囊碘泡虫孢子。 1.2 方法 1.2.1防脱玻片的处理 把一块通过多聚赖氨酸处理的载玻片（防脱玻片，市场上有商品）裁成近似正方形的三块备用。 1.2.2 从鱼鳃上剥离圆形孢囊，保存于蒸馏水中，使用时从新鲜孢囊中吸取白色液体（内有瓶囊碘泡虫孢子）滴于防脱普通玻片（5cm×5cm）上，待干后，放入六孔板内，2.5%戊二醛固定2h，用0.1 M PBS缓冲液清洗2次，乙醇梯度脱水后经叔丁醇梯度置换，临界点干燥仪干燥，最后导电镀膜。Hatchi S-3400NⅡ扫描电镜对样品进行观察 [3，5,6] 1.2.3 改进方法 从新鲜孢囊中吸取液体约0.3－0.5ml，放入2 ml大小的PE管中，加入2.5%戊二醛固定2h，0.1 M PBS缓冲液清洗2次，匀浆器匀浆，1000r/min离心5分钟，吸去上清液，再加入0.1 M PBS缓冲液离心，如此反复3次即可得到较纯净、浓缩的孢子悬液。取瓶囊碘泡虫孢子悬液一滴，滴于防脱玻片中央，用滴管吹散，待干。乙醇梯度脱水后经叔丁醇梯度置换，干燥，镀膜，Hatchi S-3400NⅡ扫描电镜观察。 1.2.4 再次改进 在以上改进方法的基础上，取一滴浓缩的瓶囊碘泡虫孢子悬液滴于处理过的防脱玻片边缘，用一张干净的盖玻片轻轻推片，使悬液能均匀的涂在玻片上面，其余步骤同改进方法。 2 结果与讨论 2.1不同方法处理样品的观察结果 常规方法扫描电镜下观察到虫体孢子成团聚集，部分孢子散布在大量粘液与细碎的组织中间，孢子表面结构模糊（图-1）。 改进方法后，观察到图像较清晰，孢子表面无粘液覆盖，有少量杂质，能看到一个个的孢子，孢子失水相对较少。缺点是虫体密集，相互重叠，细微结构辨别困难（图-2）。 再次改进方法后，虫体分布均匀，相互之间很少重叠，虫体表面无粘液覆盖，表面“沟回”结构清晰可见（图-3，4，5）。 2.2 讨论 粘孢子虫孢子表面有比较硬的几丁质外壳，扫描电镜样品制备时不易附着于玻片上，为了防止在处理过程中孢子脱落，常使用防脱玻片，孢子粘附牢固，在固定、脱水过程中孢子很少脱落。 常规方法，瓶囊碘泡虫孢子由于没有经过稀释、离心的处理，样品没有充分清洗、提纯，造成镜下观察虫体孢子成团聚集，并附有大量粘液与杂质，影响观察结果。 改进方法，先固定，再匀浆和离心，能够保证孢子的原始形貌，同时将孢子上覆盖的粘液及细碎的组织清洗、分离干净。经后续常规处理，镜下看到的孢子形态饱满、真实，但孢子仍然聚集成团，难以分散，影响对孢子的单个观察与分析。 为了解决孢子聚集成团的问题，在以上改进方法的基础上，再次改进方法。将处理好的孢子悬液滴在防脱玻片边缘，用清洁的盖玻片轻轻推片，推出的样品能均匀地涂在玻片上面，