姜黄素影响α-synuclein过表达诱导的α-synuclein寡聚体形成及关线粒体atp敏感性钾通道改变的研究.docx

JIMIIIIIJJJ]IIIJJlJIJJJIIWIIIIIIIJY31 JIMIIIIIJJJ]IIIJJlJIJJJIIWIIIIIIIJ Y31 I 6975 博士学位论文 姜黄素影响伐．synuclein过表达诱导的仅． synuclein寡聚体形成的动力学及线粒体 ATP敏感性钾通道改变的研究 博士研究生：邓益东 指导教师：潘速跃 摘要 研究背景 帕金森病(Parkinson disease，PD)仅次于阿尔茨海默病，是最常见于中老 年人群的第二大神经系统变性疾病。其病因至今尚未明确。遗传因素、环境因 素、年龄老化、炎性损伤等均可能参与了PD多巴胺能神经元的变性死亡过 程。PD主要的神经病理学特征是中脑黑质多巴胺能神经元大量变性坏死及变 性神经元胞浆内嗜酸性包涵体．路易体(1ewy body，LB)形成。 cL．突触核蛋白(0L．synuclein)是帕金森病(Parkinson disease，PD)患者变 性神经元胞浆内LB的主要成分。u．synuclein病理性聚集过程中形成的寡聚体 是帕金森病临床症状发生、发展及受累脑区变性的主要原因，a．synuclein寡聚 体可能是神经元凋亡的启动因素之一，对帕金森病的发病过程起着重要作用。 在帕金森病的发生形成过程中，仪．synuclein聚集状态的变化是一个关键因素。 在自然状态，0L．synuclein呈无序未折叠结构，而在0L-synuclein表达水平增高 时，它可转变成p．淀粉纤维样的折叠结构，构成寡聚体。出现这种改变后，将 万方数据 摘要导致细胞毒性、细胞死亡，表现为对突触前囊泡池变小，线粒体功能障碍，细 摘要 导致细胞毒性、细胞死亡，表现为对突触前囊泡池变小，线粒体功能障碍，细 胞内活性氧水平增加。寡聚体因含有大量的p．折叠区域，其中疏水残基被从蛋 白质表面挤压出来，与突触囊泡更加紧密结合，类似于成孔细菌毒素，在突触 囊泡上产生小孔，使囊泡的通透性增加，钙离子内流，多巴胺外漏，线粒体膜 去极化近而导致细胞死亡。有研究表明，突变型0【．synuclein和野生型Ⅱ． synuclein的过度表达均可加速转基因帕金森病果蝇、猴、鼠模型中a-synuclein 蛋白寡聚体形成，故寡聚体的细胞毒性可能是持续存在。在PD患者脑组织 内，寡聚体的积聚甚于纤维多聚体，提示仪．synuclein寡聚体可能为PD的发病 基础。Auluck等在中脑多巴胺神经元细胞发现q．synuclein寡聚体的形成和稳定 性是由饱和和不饱和脂肪酸调节的，并可因0【．synuclein基因A53T突变而改 变。我们的前期研究证实a．synuclein的过度表达，诱导了HEK293细胞内蛋白 病理性聚集和Lewy体形成。 通道假说是目前关于1／,．synuclein寡聚体细胞毒性机制的一种主流假说，认 为a．synuclein寡聚体的细胞毒性类似于一些细菌毒素，能在细胞膜上形成孔状 通道或导致一些膜离子通道的改变，使Ca2+大量进入细胞，表现出Ca2+依赖性 的细胞毒性，最终导致线粒体损伤、活性氧增加和细胞凋亡。 细胞凋亡或坏死时细胞膜结构出现破坏，导致细胞浆内的多种酶溢出到培 养液里，乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LDH)是一种稳定的胞浆酶，广泛 存在于所有的细胞中，当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。通过检测从胞 膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定 量分析。LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检 测。线粒体膜电位(mitochondrial membrance potentil，Aq。m)的下降是细胞凋亡 早期的一个标志性事件。通过JC．1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地 万方数据 博士学位论文检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC．1从红色荧光到绿色荧光的转变作 博士学位论文 检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC．1从红色荧光到绿色荧光的转变作 为细胞凋亡早期的一个检测指标。 通过对1．甲基．4-苯基．1，2，3，6．四氢吡啶(MPTP)致病造模的小鼠及基因敲 除小鼠帕金森病模型的研究发现，线粒体膜上ATP敏感性钾离子通道(ATP sensitive potassium channel，KATP)的功能亚基Kir6．2的失活可以有效阻止DA 能神经元的变性或死亡。研究发现，在6-OHDA大鼠帕金森病模型中，毁损侧纹 状体Kir6．1、Kir6．2和Surl的表达较对侧明显增高，并且KATP开放剂 iptakalim(Ipt)可以部分改善PD动物模型的运动症状。KATP是一类耦联细胞代 谢和电活动、以细胞内的ATP／ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾 离子通道，利用原位杂交、免