分子生物学材料和方法杂烩..docx

小鼠腹腔原代巨噬细胞的诱导及鉴定 复苏小鼠腹腔原代巨噬细胞，37℃、5%CO2孵箱常规培养； 培养8-12h后在培养体系中分别加入PMA刺激原代腹腔巨噬细胞36h；以20ng/ml IL4刺激原代腹腔巨噬细胞36h； 选取CD206作为M2型巨噬细胞的标记物； 流式细胞术检测巨噬细胞表面分子CD206的表达，qRT-PCR法检测巨噬细胞CD206和Arg-1的表达。 流式细胞术检测巨噬细胞表面分子CD206的表达 按步骤1分别获得的PMA诱导的腹腔巨噬细胞和IL-4诱导的腹腔巨噬细胞； 经0.25%胰酶消化后收集各组巨噬细胞，计数，用预冷的PBS将细胞浓度调整到2×106/ml，离心定容至100μl； 在细胞悬液中分别加入5μl PE anti-mouse CD206（MMR）（0.2mg/ml），4℃避光孵育30min； 用1ml预冷的PBS洗2遍，4℃，3000rpm，离心5min，吸去上清； 用200μl预冷的PBS重悬细胞，或用1%多聚甲醛溶液固定，流式细胞仪检测各表面分子的表达。 M2型巨噬细胞与胃癌共培养 以IL-4诱导小鼠腹腔巨噬细胞48h后，形成的M2型巨噬细胞经0.25%胰酶消化，计数并更换新鲜培养基，以2×10*6/ml平铺于六孔板中；将纯化胃癌细胞加入培养体系中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，36h收集上清用于细胞因子和NO分泌的检测。 M2型巨噬细胞与胃癌细胞共培养实验分组： 1：M2型巨噬细胞+None 2：M2型巨噬细胞+miR-Ctrl胃癌细胞 3：M2型巨噬细胞+miR-142-5p过表达胃癌细胞 4：M0型巨噬细胞+miR- 4． 细胞培养上清的制备： 共培养36h后，收集上清于离心管中，4℃、12,000rpm，离心5min，立即进行细胞因和NO的检测或分装后储存于-80℃冰箱中。 人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的培养 活细胞计数 用无血清培养基把悬液稀释到200-2000个/ml，将0.1ml的0.4%的台盼蓝溶液加入0.1ml的细胞悬液中，轻轻吹匀。数分钟后，用血球计数板计数细胞。染成蓝色的细胞是死细胞（活细胞排斥台盼蓝） M2型巨噬细胞的体外诱导 取对数生长期的THP-1细胞，将其传代接种于六孔板中，控制细胞数约1×10*5/ml每孔。向培养基中加入45ng/ml IL-4，继续培养6天，收获不同激活状态的巨噬细胞进行后续实验。 细胞上清的制备 用无菌Ep管收集不同激活状态下巨噬细胞分泌上清，4℃、3000rpm离心20min，收集上清，分装后储存于-80℃冰箱中。 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测胞内IL-10的表达水平 刺激细胞：将刺激剂BD GolgiPlug TM在室温下解冻，于每毫升细胞培养液中加入1μl刺激剂，充分混匀，将细胞置于5%CO2、37℃培养箱中继续培养不超过12小时。 收获细胞：将细胞悬液移入Ep管中，4000rpm×5min离心，小心弃去上清，PBS洗涤3次，获得细胞沉淀。 骨髓来源巨噬细胞M2型巨噬细胞的建立 将分离到的骨髓细胞用RPMI1640 培养液制备细胞悬液，加入75cm2培养瓶中，37℃、5%CO2温箱中孵育24h，培养箱中培养2h，吸取未贴壁细胞，1500rpm，离心5min，加入10cm玻璃皿中，然后向其加入含100ng/ml M-CSF的RPMI1640完全培养液，37℃、5%CO2培养箱内培养7d，收获贴壁细胞，细胞计数，调整细胞密度为3×10*6/ml，加入六孔细胞培养板，分别加入100ng/ml M-CSF、40ng/ml IL-4和Transwell小室（4μm，内铺单层胃癌细胞）建立M2-like、M2a、TAM三种M2表型巨噬细胞。 流式细胞术 将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，1500rpm离心5min，弃上清液。 以冷PBS离心洗涤，弃上清液。 加入PBS稀释的荧光素标记抗体200μl。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或冰上孵育30min-1h 离心弃去上清液 加入冷PBS 1ml，离心洗涤3次，除去未结合的多余抗体成分。 向细胞中加入冷PBS 500μl，吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 参照体外培养的经典方法，IFN-γ及LPS可将骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型，IL-4将其诱导M2型，不同类型巨噬细胞的功能差异与精氨酸代谢不同有关，两种代谢途径关键酶iNOS和Arg-1相互竞争，分别介导巨噬细胞的抗感染和组织损伤修复的功能。因此通过WB分析IL-23处理M2型巨噬细胞后iNOS和Arg-1的表达水平变化，来评价巨噬细胞表型是否发生了转化。 1. 胃癌细胞/THP-1共培养体系的建立 收获条件培养基：诱导M1及M2型巨噬细胞结束后，更换含RPMI1640/2%FBS培养基，继续培养