分子生物学平台上的食品微生物快速检测及鉴定技术..ppt

* * * * Further multiplexing facilitated by incorporation of mobility modifiers and multiple dyes；在真核生物基因组中存在大量的数目可变的衔接重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)。VNTR是由几个核苷酸(最常见为2～4个)作为核心序列串联重复形成的DNA序列，在原核生物基因组中也发现了这种序列，但它的一般长度不到原核生物基因组的1/10。这种序列可存在于原核生物基因中，也可存在于基因之间。 * * 大肠杆菌O157：H7中发现，有7个VNTR，重复数从6～30个碱基不等，其中6个存在于染色体DNA上，另一个存在于编码毒力基因的质粒上。通过不同菌株基因组核心序列串联重复数的差异，可检测大肠杆菌O157：H7的多态性。Lindstedt等［24］用MLVA方法，将69株大肠杆菌O157分为45个不同型别，用PFGE方法将它们分为44个，证明ML2VA与PFGE相比具有相同的灵敏度和更高的特异性，具有很多优点。首先，它无需抽提基因组DNA；其二，该法重复性好，即使不同实验者也可得到相同的条带形式；第三，可制定统一标准，易于各实验室间进行比较；第四，能在较短时间内处理大量样品。运用分子生物学分型方法检测大肠杆菌O157：H7的多态性，为调查其是否潜在暴发流行提供了有效手段。菌株的分型使得研究食品工业中O157：H7的污染检测也更为方便，关键控制点易于找到，使得有适当措施被贯彻来保证食品的安全。 * * * * 遗传分析仪在MLVA研究中的应用 多重 PCR 选择正确的扩增引物是取得成功的关键 16 个甚至更多的 STR 位点同时被扩增 7 repeats 8 repeats STR 位点 由特定引物延伸的旁侧序列具有保守性 不同菌株的串联重复序列拷贝数存在差异 AMEL D3 TH01 TPOX Penta D Penta E FGA D21 D18 CSF D16 D7 D13 D5 VWA D8 由遗传分析仪电泳分离PCR扩增产物/片段 结合不同的荧光染料标记和迁移率的修饰技术，实现多重分析 * STEC O157/ Salmonella Typhimurium Protocol MLVA 是食源性微生物分型国际组织Pulsenet推荐的食品微生物分型方法， 中国CDC及各省级CDC均设立相关机构参与其中. * 大肠杆菌7个位点的 MLVA， 实现对O157:H7 的分型 Lindstedt, et al. (2003) Ann. Clin. Microbiol. Antimicr., 2, 12. Seven locus MLVA scheme in a single dye channel Identified 47 distinct MLVA patterns among 73 O157:H7 strains Sequence alignment of the Vhec4 VNTR loci from isolates G5300 and IHE5344. The results from the sequencing show that the electrophoretic mobility shift between isolates IHE5344 (upper strand) and G5300 (lower strand) is caused by different numbers of AAATAG repeat units alone Escherichia coli O157 MLVA Fragment patterns generated from seven VNTR loci showing two identical and one different profile. Comparison of the MLVA profiles of three O157:H7 STEC cattle isolates. These isolates were all identical by previous XbaI PFGE and AFLP typing. The MLVA assay confirmed that isolates 126/97 (upper panel) and 131/97 (middle panel) were identical, but displayed a clearly distinct profile for isolate 127/97 (lower panel). * Applied Biosystems 遗传分析仪