华蟾素对h22肝癌细胞诱导免疫细胞合成释放β-end的影响-药理学专业论文.docxVIP

II II 内 容 摘 要 目的：建立小鼠脾淋巴细胞和小鼠 H22 肝癌细胞体外共培养模型，使用华蟾素干 预共培养模型，观察上清液中 β-END 和细胞因子 CRF 含量，检测免疫细胞内 POMC 和 CTSL 的基因表达，探索华蟾素对免疫细胞的增殖促进作用和趋化作用。从而为华 蟾素从 β-END-μ-POMC 途径治疗癌痛的机制研究提供理论依据。 方法：(1) 提取小鼠脾淋巴细胞，制备小鼠H22肝癌腹水细胞，体外将两种细胞按 照一定浓度比共培养。(2) ELISA法测定华蟾素促进免疫细胞释放β-END的含量来选 择测定指标的最佳时间以及共培养的最佳浓度比。ELISA法测定华蟾素对共培养模型 上清液中细胞因子含量的影响。(3) MTT法和细胞计数法比较华蟾素对免疫细胞和肝 癌细胞生长情况的影响。(4) 荧光定量PCR检测免疫细胞中POMC和CTSL的基因表达 水平。(5) Transwell趋化实验测定华蟾素对免疫细胞的趋化作用。 结果：(1) 成功建立小鼠脾淋巴细胞和H22肝癌腹水细胞的体外共培养模型。(2) 根据华蟾素促进免疫细胞释放β-END的含量选择测定指标的最佳共培养时间为24h， 脾淋巴细胞和H22肝癌细胞的最佳浓度比为10:1。且不同浓度华蟾素均能显著性地增 加共培养模型上清液中β-END的含量(P0.01)。(3) 不同浓度的华蟾素均能明显促进免 疫细胞以及共培养后的免疫细胞的增殖，与空白对照组相比，二者在24h、48h均具有 显著性统计学差异(P0.01)。不同浓度的华蟾素对H22肝癌细胞和共培养后的H22肝癌 细胞均有抑制作用(P0.01)。(4) 荧光定量PCR检测华蟾素1/40能够显著促进免疫细胞 中POMC和CTSL的基因表达水平，与对照组相比，具有显著性统计学差异(P0.01)。 (5) Transwell趋化实验测定华蟾素对免疫细胞有明显的趋化作用。 结论：在体外的小鼠脾淋巴细胞和H22肝癌细胞共培养模型中，华蟾素能够促进 共培养上清液β-END和细胞因子CRF的含量，增加β-END的前体蛋白POMC和CTSL 的基因表达水平。华蟾素能够抑制肝癌细胞的同时促进免疫细胞的增殖作用和趋化作 用。推测华蟾素可能通过提高β-END的合成和释放，并且促进免疫细胞的增殖和募集， 从β-END-μ-POMC途径发挥局部镇痛作用。 关键词：华蟾素 共培养 免疫细胞 趋化作用 β-END III III Abstract Objective In this study, we established the co-culture model of splenic lymphocyte and H22 hepatoma carcinoma cell in mice in vitro. We observed that whether Cinobufotalin can promote the release of β-END in supernate and the expression of CRF、IL-1 and the gene expression of POMC and CTSL. To explore the proliferation of Cinobufotalin affect immune cell in alone and in the co-culture model. To detect the chemotaxis of Cinobufotalin influence immune cell, in order to provide theory for the mechanism of Cinobufotalin treated cancer pain based on the pathway of β-END-μ-POMC. Methods (1) We prepared splenic lymphocyte and H22 hepatoma carcinoma ascite cell from mice, take this two cells to co-culture according to a certain concentration ratio. (2) The content of β-END in supernate were measured by ELISA in order to select the optimal time and the optimal concentration ratio of the index mensuration. ELISA method detected Cinobufotalin influence the conten